2020年7月26日訊/
生物谷BIOON/---據世界衛生組織（WHO）統計，截至2020年6月8日，2019年冠狀病毒病(COVID-19)大流行已導致200多個國家/地區的700多萬感染，並造成40萬人死亡。導致這次大流行的病原體是一種新出現的冠狀病毒：SARS-CoV-2，它與密切相關的SARS-CoV同屬於冠狀病毒科β冠狀病毒屬B譜系。位於SARS-CoV-2和SARS-CoV包膜的刺突糖蛋白（S）具有大約80%的胺基酸序列一致性，而且這兩種病毒均利用人血管緊張素轉化酶2（hACE2）進入宿主細胞。細胞進入是通過S蛋白同源三聚體介導的病毒-受體結合實現的，然後是病毒-宿主膜融合，其中這種結合是通過S蛋白的受體結合結構域（RBD）進行的。破壞S蛋白在感染建立中所發揮的這一關鍵作用是中和抗體的主要目標，也是治療性幹預和疫苗設計的重點。
之前表徵的幾種SARS-CoV中和抗體（NAb）被證明對SARS-CoV-2的中和活性非常有限。在這些中和抗體中，CR3022是一種針對SARS-CoV的弱中和抗體，雖然可以緊密結合SARS-CoV-2，但對後者無中和作用，這表明中和表位可能存在構象差異。近期的研究報導了兩種SARS-CoV中和抗體47D11和S309也被發現可以中和SARS-CoV-2，這提示著β冠狀病毒屬B譜系內存在廣泛的交叉中和表位。含有SARS-CoV-2中和抗體的恢復期血漿已被發現可以為COVID-19患者提供明確的保護，然而科學家們對SARS-CoV-2的免疫原性特徵和關鍵表位的了解還存在差距，這阻礙了為這種病毒開發有效的免疫療法。
SARS-CoV和SARS-CoV-2的RBD具有大約75%的胺基酸序列一致性，因此有可能發現靶向RBD的交叉中和抗體。在一項新的研究中，來自中國科學院、中國科學院大學、中國軍事醫學科學院、中國食品藥品檢定研究院、中國醫學科學院、北京協和醫學院、北京神州細胞生物技術公司和北京義翹神州科技公司的研究人員通過使用噬菌體展示技術，構建出一個抗體庫，該抗體庫是從由用重組SARS-CoV RBD免疫的小鼠的外周淋巴細胞中提取的RNA產生的。利用SARS-CoV-2 RBD作為篩選噬菌體抗體庫的靶點，尋找潛在的命中目標。將顯示與SARS-CoV-2 RBD緊密結合的抗體作為嵌合抗體進行進一步優化，並使用基於水泡性口炎病毒（VSV）的假型病毒系統測試它們的中和活性。相關研究結果於2020年7月23日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Structural basis for neutralization of SARS-CoV-2 and SARS-CoV by a potent therapeutic antibody」。
在測試的抗體中，對SARS-CoV-2假病毒具有強效中和活性的抗體克隆014進行人源化，並將它命名為H014。為了評估結合親和力，利用OCTET系統監測H014與SARS-CoV-2 RBD或SARS-CoV RBD的實時結合和解離。H014 IgG和它的Fab片段均表現出與SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD的緊密結合，與這兩種RBD在亞nM水平上具有相當的結合親和力（圖1A）。
圖1.H014是一種具有治療價值的B譜系冠狀病毒交叉中和抗體，圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abc5881。
假病毒中和試驗顯示H014具有強效的中和活性：對SARS-CoV-2和SARS-CoV假病毒的50%中和濃度值（IC
50）分別為3 nM和1 nM（圖1B）。對真正的SARS-CoV-2毒株（BetaCoV/Beijing/AMMS01/2020）進行的斑塊還原中和試驗（plaque-reduction neutralization test, PRNT）驗證了它的中和活性：它的IC
50為38 nM，比在假型病毒系統中觀察到的低10倍（圖1C）。這些作者接下來試圖評估H014在他們先前建立的hACE2人源化小鼠模型中的體內保護功效，其中這種小鼠模型對SARS-CoV-2感染敏感。
在這種小鼠模型中，由於hACE2在肺細胞表面上的表達，SARS-CoV-2進入肺部，並像在人體中一樣複製，在感染5天後表現出肺部病變。hACE2人源化小鼠在5×10
5PFU的SARS-CoV-2（BetaCoV/Beijing/AMMS01/2020）鼻內感染4小時後（1劑，治療）或12小時前和4小時後（2劑，預防加治療），腹腔注射50mg/kg的H014進行治療。所有遭受病毒挑戰的小鼠在第5天時被殺死。雖然PBS組（對照組）小鼠肺部的病毒載量在第5天飆升至約10
7RNA拷貝/g（圖1D），但是值得注意的是，在預防組和預防加治療組小鼠中，H014治療使得它們的肺部的病毒滴度在第5天分別降低了大約10倍和100倍（圖1D）。肺部病理分析顯示，SARS-CoV-2在磷酸鹽緩衝液（PBS）處理後引起輕度間質性肺炎，其特點是炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚和明顯的血管系統損傷。相比之下，在接受H014治療的小鼠的肺切片上未觀察到明顯的肺泡上皮細胞病變或局灶性出血（圖1E），這表明H014在治療COVID-19方面具有潛在的治療作用。
SARS-CoV-2 S蛋白三聚體的整體結構與SARS-CoV和其他冠狀病毒相似。S蛋白的每個單體由兩個功能性亞基組成。S1亞基結合宿主細胞受體，而S2亞基介導病毒膜與宿主細胞膜的融合。S1亞基內的四個結構域包括N端結構域（NTD）、RBD和兩個亞結構域（SD1和SD2），這兩個亞結構域的位置與S1/S2的切割位點相鄰。RBD的鉸鏈樣運動產生了兩種不同的構象狀態，稱為「關閉」和「開放」，其中關閉狀態對應於受體不可訪問狀態，開放狀態對應於受體可訪問的狀態，這應該是是亞穩定的。
對穩定化的SARS-CoV-2 S蛋白的胞外結構域與H014 Fab片段形成的複合物的低溫電鏡（Cryo-EM）結構表徵發現，這種複合物採用三種不同的構象狀態，分別對應一個RBD開放+兩個RBD關閉（狀態1）、兩個RBD開放+一個RBD關閉（狀態2）和三個RBD全部開放（狀態3）（圖2A）。有趣的是，儘管存在過多的Fab，但是完全關閉（狀態4）的SARS-CoV-2 S蛋白三聚體在沒有任何Fab結合下的結構也在Cryo-EM數據的三維分類過程中觀察到，這提示著H014的結合位點通過蛋白「呼吸」暴露，隨後進行隨機RBD運動（圖2A）。這些作者在3.4～3.6 埃米的解析度下對這4種狀態的S蛋白進行不對稱cryo-EM重建。然而，由於構象的異質性，RBD和H014之間的結合界面的電子勢圖相對較弱。為了解決這個問題，他們採用 「基於區塊」的重建方法進行了聚焦分類和精細化處理，進一步提高了局部解析度至3.9埃米，從而使得對相互作用模式的分析更為可靠。利用結合界面結構對H014和S蛋白之間的相互作用進行了詳細分析。
圖2.SARS-CoV-2 S蛋白三聚體與H014形成的複合物的低溫電鏡（Cryo-EM）結構，圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abc5881。
H014識別位於開放RBD一側的構象表位，僅涉及蛋白/蛋白接觸，這與受體結合基序（RBM）不同（圖2B）。H014補位（paratope，即抗體決定簇）構成了所有六個互補決定性區（CDR）環（CDRL1-3和CDRH1-3）和不尋常的重鏈框架（HF-R，殘基58-65），這就與RBD形成緊密的相互作用，從而產生了大約1000平方埃米的埋藏區域（圖2C）。
H014輕鏈和重鏈的可變區通過疏水和親水接觸分別貢獻了大約32%和68%的埋藏表面積。這個H014表位由21個殘基組成，主要定位在α2-β2-η2 (殘基368-386)、η3 (殘基405-408、411-413)、α4(殘基439)和η4(殘基503)區域，從而在RBD的一側形成了一個空腔(圖2、B和D)。一個長12個胺基酸殘基的CDRH3插入該空腔，富含疏水殘基（YDPYYVM）的CDRH3與RBD的五股β-摺疊(β2)區域的η3和邊緣接觸(圖2D)。RBD和H014之間的緊密結合主要是由於由兩個片塊（patch）貢獻的廣泛的疏水相互作用，其中的一個片塊是由來自CDRH2的F54、來自CDRH3的Y101和來自RBD的A411、P412和Y508形成的，另一個片塊是由來自CDRL2的Y49、來自CDRH3的P103、Y104、Y105和來自RBD的V407、V503和Y508組成的（圖2E）。此外，來自CDRH1和HF-R的親水接觸進一步增強了RBD-H014的相互作用，從而導致在25℃或37℃的溫度下在亞nM水平上具有極高的結合親和力（圖2E）。構成該表位的殘基大多是保守的，在目前報導的在人群中傳播的SARS-CoV-2毒株中，這個區域出現3個單位點突變（R408I、N439K和V503F）。
另外，一些SARS-CoV-2分離株在RBD中攜帶一個共同的突變V367F，這個突變位於主要表位片塊（epitope patch）α2-β2-η2附近。攜帶上述胺基酸殘基點突變和其他已報導的替代突變的重組RBD構建物與H014的結合親和力是難以區分的，這提示著H014可能對目前在全球範圍內傳播的SARS-CoV-2毒株具有廣泛的中和活性。在這個H014表位的21個胺基酸殘基中，SARS-CoV-2和SARS-CoV之間有17個殘基（81%）是相同的，這解釋了交叉反應性和相似的結合親和力。
為了研究H014是否幹擾SARS-CoV-2或SARS-CoV的RBD與hACE2的結合，這些作者在蛋白和細胞水平上進行了競爭性結合試驗。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）結果表明，H014能夠與重組hACE2競爭性地結合SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD，EC
50值分別為0.7 nM和5 nM（圖3A）。此外，H014既能有效阻斷SARS-CoV-2 RBD與表達ACE2的293T細胞的結合，又能阻斷重組ACE2與表達SARS-CoV-2 S 蛋白的293T細胞的結合（圖3B）。
圖3.H014的中和機制，圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abc5881。
為了驗證H014對S蛋白三聚體的潛在完全封閉，這些作者進行了兩組表面等離子共振（SPR）測試，先將S蛋白三聚體暴露於H014，然後再暴露於hACE2，或者反過來。正如預期的那樣，H014的結合完全阻斷了hACE2對S蛋白三聚體的附著。再者，hACE2可以從S蛋白三聚體移出而被H014取代（圖3C）。為了在一種基於細胞的病毒感染模型中進一步驗證這些結果，他們進行了實時RT-PCR分析，以定量確定殘留在4℃下在病毒附著之前或之後暴露於抗體中的宿主細胞表面上的病毒載量。
H014以劑量依賴的方式有效地阻止SARS-CoV-2附著到細胞表面上，而且已經結合到細胞表面上的病毒顆粒可以被H014部分釋放下來（圖3D）。將H014-SARS-CoV-2三聚體S蛋白複合物的結構與ACE2-SARS-CoV-2 RBD複合物的結構疊加在一起，可發現hACE2和H014之間發生衝突的原因位於RBD頂端螺旋（η4）的結合位點所屬區域存在重疊（圖3E）。這一觀察結果與大多數已知的SARS-CoV RBD-靶向抗體複合物的觀察結果大不相同，其中這些靶向抗體直接識別RBM。因此，H014阻止SARS-CoV-2附著於宿主細胞的能力可以歸因於與hACE2之間存在立體衝突。
類似於RBM的是，這個H014表位只能在開放狀態下訪問，這表明它存在這種類似於RBM的作用---涉及對與宿主細胞的相互作用的動態幹擾。這些作者觀察到的結構連同以前報導的冠狀病毒S結構（不包括人類冠狀病毒HKU1），已揭示了S1亞基的呼吸介導「關閉」和「開放」構象之間的過渡（圖4A）。與大多數結構中觀察到的RBD的鉸鏈狀運動不同的是，在這些作者的結構中觀察到的從「關閉」到「開放」的構象轉變主要涉及兩個旋轉步驟：1)SD1圍繞鉸鏈點（在胺基酸殘基320處）逆時針旋轉大約25°；2)RBD自身逆時針旋轉大約60°（圖4B）。SD1和RBD在近端位置的構象旋轉會導致遠端位置的變化放大，從而為H014或ACE2的結合開闢了足夠的空間（圖4B）。不明確的地方在於，在這些作者的複合物結構中觀察到的特殊構象轉變是H014參與的結果，還是SD1和RBD協同運動的結果。
圖4.S1亞基的呼吸和中和抗體的表位，圖片來自Science, 2020, doi:10.1126/science.abc5881。
體液免疫對預防冠狀病毒感染至關重要，而恢復期血漿的被動免疫已被證明對治療SARS和COVID-19有效。人們之前已報導在RBD處於開放構象下，一些SARS-CoV特異性中和抗體，包括m396、80R和F26G19，主要結合RBM核心（SARS-CoV中的胺基酸殘基484-492）（圖4、C和D）。意外的是，到目前為止，這些抗體都沒有對SARS-CoV-2表現出令人印象深刻的中和活性。作為一種在功能上模擬受體附著並促進膜融合的SARS-CoV中和抗體，S230儘管也需要RBD處於開放狀態，但是它能識別位於RBM頂部的一個小片塊（圖4，C和D）。近期，另外兩種抗體（CR3022和S309）源於2003年SARS倖存者的記憶B細胞，表現出與SARS-CoV-2的強效結合。令人吃驚的是，CR3022未能在體外中和SARS-CoV-2，這可能是由於CR3022結合了一個遠離RBD的隱性表位，只有當至少兩個RBD處於開放狀態時才能進入這個表位。此外，CR3022不與hACE2競爭與RBD的結合（圖4，C和D）。
相比之下，S309是最近報導的一種針對SARS-CoV和SARS-CoV-2的中和性mAb，它能識別一個在SARS-CoV和SARS-CoV-2 RBD的開放和關閉狀態下均可訪問的保守性含聚糖表位。S309的中和機制並不依賴於直接阻斷受體結合，但是它能誘導抗體依賴性細胞毒性（ADCC）和抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）。這些作者報導了一種強效的治療性抗體H014，它可以通過阻斷病毒與宿主細胞的結合來交叉中和SARS-CoV-2和SARS-CoV感染（圖3）。與其他抗體不同的是，H014結合了RBD的一個完整側面，從近端η2一直到RBM的遠端邊緣，並與m392、80R、F26G19、CR3022和S309等SARS-CoV特異性抗體具有部分重疊的表位（圖4、C和D）。
雖然SARS-CoV和SARS-CoV-2都利用hACE2進入宿主細胞，但已觀察到這兩種病毒的RBM存在較高的序列變化和RBM遠端發生局部構象重排。這很可能導致一些抗體，特別是靶向SARS-CoV RBM的抗體，在交叉結合和交叉中和SARS-CoV-2時遭遇失敗。三種交叉反應性抗體（CR3022、S309和H014）能識別位於RBM之外的更多保守性表位，其中CR3022表位與RBM距離最遠（圖4、C和D），這提示著這可能是它不能中和SARS-CoV-2的原因。H014結合了更多的保守性表位，其中的一些表位與RBM很接近，從而使得它能有效地交叉中和B譜系冠狀病毒。此外，識別RBM以外更多保守性片塊的抗體將與靶向RBM的抗體協同作用以增強中和活性，從而可能降低病毒逃逸的風險。這項新研究中揭示的H014表位的分子特徵有利於發現B譜系冠狀病毒中的廣泛交叉中和表位，並為基於結構的合理疫苗設計提供了令人關注的靶標。這些作者的研究結果也凸顯了基於抗體的治療性幹預措施治療COVID-19的前景。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：Zhe Lv et al. Structural basis for neutralization of SARS-CoV-2 and SARS-CoV by a potent therapeutic antibody. Science, 2020, doi:10.1126/science.abc5881.