...北京大學陳雷研究組報導NALCN-FAM155A亞通道複合體的高分辨結構

供稿 | 陳雷研究組

責編 | 吉 佳

鈉通道NALCN複合體主要位於神經元細胞膜上，介導了電壓調控、胞外鈣離子阻塞的鈉漏電流，使靜息電位偏向於去極化，從而提高神經細胞的興奮性（1-4）。NALCN通道亞基在哺乳動物中高度保守，與電壓門控鈣離子通道（CaV）和電壓門控鈉離子通道（NaV）具有一定的同源性。NALCN的功能異常會導致多種嚴重的神經疾病（5），例如：患有精神運動發育遲緩和特徵面相的小兒肌張力低下（IHPRF）（6,7）、四肢和面部先天性攣縮、肌張力低下和發育遲緩（CLIFAHDD）（8）等。除此之外，也有報導顯示NALCN參與了呼吸節律（1）、痛覺感知（9）、生物鐘（10）和快速動眼睡眠（11）等重要的生物學過程。

儘管NALCN通道有著如此重要的功能，但其工作機制仍不清楚。有報導顯示在HEK293和爪蟾卵母細胞等異源體系中，只有共同表達NALCN、FAM155、UNC79和UNC80四個亞基，才能測量到典型的鈉漏電流（2）。其中，NALCN是孔道形成亞基（1,2）；FAM155是跨膜調控亞基，協助NALCN上膜（12）；而UNC79和UNC80是分子量巨大（300 kD和370 kD）且功能尚不清楚的調控亞基（2,4）。

2020年12月3日，北京大學陳雷研究組在 Nature Communications 雜誌上報導了哺乳動物NALCN-FAM155A亞通道複合體的高分辨結構。本項研究使用單顆粒冷凍電鏡技術來探究NALCN的工作機制。由於NALCN-FAM155-UNC79-UNC80四元複合體不夠穩定，作者在此聚焦於較穩定的NALCN-FAM155核心亞複合體的結構解析。經過同源蛋白篩選等步驟，作者確定以大鼠NALCN和小鼠FAM155A亞基組成的複合體為研究對象，並在克服了樣品製備、數據處理等困難後，通過單顆粒冷凍電鏡技術獲得了2.65 Å高解析度的NALCN-FAM155A複合體的電子密度，並根據同源蛋白結構搭建了原子模型。

結構顯示NALCN整體結構與CaV和NaV的結構類似，由四個同源但不相同的重複結構域（DI-DIV）組成，每個重複含有6個跨膜螺旋（S1-S6），其中位於中心的S5-S6形成了孔道區，而位於四周的S1-S4組成了電壓感受結構域（VSD）。胞外FAM155A的半胱氨酸富集結構域（CRD）像蓋子一樣蓋在NALCN孔道結構域的頂端，並與NALCN的胞外loop有著複雜而緊密的相互作用。此外，NALCN的C端結構域（CTD）與III-IV螺旋（III-IV linker）及DII-DIII間的CTD相互作用螺旋（CIH）共同組成了胞內結構域（圖1）。

圖1：NALCN-FAM155A亞複合體的結構

通過計算離子通過的路徑，作者發現NALCN胞外孔道區周圍的胺基酸帶有較多負電，利於吸引胞外鈉離子並排斥陰離子。而計算出的孔道半徑顯示孔道區在兩個地方收縮的很緊，一個是靠近胞內的疏水的「門」，最小半徑小於1 Å，表明通道處於關閉狀態；另一個是靠近胞外的離子選擇過濾器，負責選擇性地通透鈉離子。序列比對的結果顯示NALCN的離子選擇過濾器由「EEKE」組成，不同於NaV的「DEKA」和CaV1.1的「EEEE」。高解析度的電子密度顯示NALCN第四個結構域的選擇過濾胺基酸E1389有兩種構象，但均不位於選擇過濾器的高場強（HFS）層，從而導致在HFS層，NALCN與NaV的電荷分布相似，均為− − + 0，這可能解釋了NALCN為何對鈉離子有更高的選擇性（圖2）。此外，有研究表明：相比於E1389，D1390對於胞外鈣離子阻塞NALCN的電流更加重要2，這也與所觀測到的結構相吻合。

圖2：NALCN孔道區的結構

NALCN通道複合體的電流也受到電壓調控，其中電壓感受結構域VSD扮演著重要角色。VSD發揮功能依賴於其內部的電荷轉移中心（CTC）和S4上連續的帶正電的胺基酸（R1-R6）。CTC主要由S2上一個芳香族胺基酸及間隔開的兩個帶負電的胺基酸（E1-F3-E4）和S3上相鄰的負電胺基酸組成。相比NaV和CaV等電壓門控離子通道，NALCN的VSD發生了不同程度的退化。根據序列比對和結構比較，可以發現NALCN的VSDI和VSDII有著完整的CTC和S4上的正電胺基酸簇；而VSDIII的CTC並不完整，缺少S2上關鍵的芳香族胺基酸；VSDIV雖然有著完整的CTC，但S4僅僅只有兩個帶正電的胺基酸（圖3）。先前的研究結果表明VSDI和VSDII的S4上的正電胺基酸對於NALCN的活性至關重要，而VSDIII和VSDIV的S4上的正電胺基酸則可有可無2，這與所觀測到的結構一致。

圖3：NALCN電壓感受結構域的結構

綜上所述，本項研究通過結構生物學技術，觀測到了哺乳動物NALCN-FAM155A亞複合體的高分辨結構，為深入理解NALCN的鈉離子選擇性、胞外鈣離子阻塞和電壓調節特性等奠定了基礎。

在本項工作的撰寫和投稿過程中，美國基因泰克公司研究組和西湖大學研究組分別在2020的Nature 13和Nature Communications 14雜誌上報導了人源的NALCN-FAM155A亞複合體2.8 Å和3.1 Å的冷凍電鏡結構。這些研究報導的結構與本研究在整體上相似，但本研究依據高質量的電子密度，發現了NALCN通道離子選擇過濾器的新構象，並搭建了CTD互作螺旋（CIH）和更加完整的FAM155A的原子模型。

本項研究主要由北京大學未來技術學院分子醫學所博士生康雲路完成，博士後吳驚香參與了電鏡數據收集的工作，陳雷研究員為通訊作者。陳雷實驗室主要研究代謝類疾病和心血管疾病藥物靶點的工作機制，長期招收對此方向感興趣的博士生和博士後。本工作獲得科技部重點研發計劃、國家自然科學基金委、生命科學聯合中心CLS和膜生物國家重點實驗室的經費支持。博士後吳驚香獲得了CLS博士後獎學金、北京大學博雅博士後獎學金、國家自然科學基金及中國博士後科學基金的支持。該工作的冷凍電鏡樣品製備、篩選和採集在北京大學冷凍電鏡平臺上完成，得到了李雪梅、郭振璽、邵博、裴霞和王國鵬等人的幫助。該項目的數據處理獲得了北京大學CLS計算平臺及未名超算平臺的硬體和技術支持。本項研究得益於賓夕法尼亞大學Dejian Ren教授贈送的大鼠和人源NALCN、小鼠UNC79和UNC80的cDNA，美國西北大學Lear Bridget教授提供的果蠅UNC79和UNC80的cDNA，美國西北大學Ravi Allada教授提供的果蠅NCA和NLF-1的cDNA，日本國立遺傳學研究所Yuji Kohara教授提供的線蟲NCA1的cDNA。

/參考文獻/

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原文連結：

https://www.nature.com/articles/s41467-020-20002-9

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原標題：《【科技前沿】北京大學陳雷研究組報導NALCN-FAM155A亞通道複合體的高分辨結構》

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