ROS（活性氧）是化學反應活性很高，並且以氧元素為主的一系列化合物，包括過氧化氫、超氧陰離子等，它們參與眾多生物學過程，同時也是一種重要的信號分子[1]。在生物體內，有很多氧化還原反應可以作為副產物產生ROS，比如線粒體呼吸鏈和P450氧化還原酶等。除此之外，還有一種專門產生ROS的酶即NADPH氧化酶（NOX），能夠受細胞信號轉導等過程的調控來產生ROS。人源NOX蛋白家族成員包括NOX1-5和DUOX1-2[2]。NOX參與了宿主防禦、分化、發育、細胞生長和存活、細胞骨架的再重建等一系列重要的生物學過程[2],[3]。DUOX1-2在甲狀腺中高表達，它們能夠催化氧氣的還原，產生過氧化氫，進一步促進甲狀腺激素的合成[4]。DUOX功能缺失性突變會導致先天性甲狀腺功能減低症[5]。
NOX家族蛋白是膜整合蛋白，它們都有一個相似的核心模塊，負責催化氧化還原反應，該模塊由雙血紅素分子結合的跨膜區（TMD）和胞內的脫氫酶結構域組成[6]。而除催化核心模塊外，DUOX蛋白還有一個過氧化物酶同源結構域PHD和兩個EF-hand結構域。此外，DUOX蛋白還需要DUOXA1輔助亞基來形成有功能的複合物[7]。據研究報導DUOX的活力受到體內鈣離子濃度的調控，鈣離子可以直接結合在DUOX上，提高DUOX的酶活力[4]。儘管DUOX和其它NOX家族蛋白有著極其重要的功能，但DUOX複合體的組裝以及鈣激活的分子機制仍不清楚。
2021年1月8日，北京大學未來技術學院分子醫學所、北大-清華生命科學聯合中心陳雷研究組在Nature Communications雜誌上報導了人源DUOX1複合體在高鈣和低鈣狀態下的兩個高分辨結構。文章連結:（ https://www.doi.org/10.1038/s41467-020-20466-9）
作者們首先通過凝膠過濾層析法確定人源DUOX1-DUOXA1可以形成穩定的異源四聚體複合物，然後通過體外活力測定的方法發現：在低鈣條件下，DUOX1複合物顯示了低的基礎活力，鈣離子的加入不僅能夠提高DUOX複合物與底物NADPH的結合親和力，還能提高DUOX1複合物的催化效率，從而增強了酶的活力。接著，作者們將純化好的DUOX1複合物重構到peptidisc中，製備了高鈣和低鈣狀態下DUOX1複合物的冷凍電鏡樣品。在克服了樣品製備、數據處理等困難後，通過單顆粒冷凍電鏡技術獲得了2.6 Å和2.7 Å高解析度的DUOX1複合體的電子密度並搭建了原子模型。
結構顯示兩個DUOX1亞基和兩個DUOXA1亞基共同組裝成一個2:2的異源四聚體複合物（圖1）。整個複合物結構分為三個部分：胞外區、跨膜區和胞內區。在胞外區，位於對角線上的兩個PHD結構域具有相互作用，同時DUOXA1的胞外區域從底部協助胞外區的排列；其跨膜區由24根跨膜螺旋組成，結合兩對血紅素，能使電子穿過細胞膜；其胞內區由起催化作用的脫氫酶結構域DH和感應鈣離子的EF-hand等結構域組成。
圖1：人源DUOX1-DUOXA1複合體在高鈣狀態下的結構
作者測量了在高鈣狀態下DUOX1結構中負責電子傳遞的各分子邊緣距離，發現NADPH-FAD-內血紅素-外血紅素間的距離分別是8.2 Å、3.9 Å和6.7 Å。儘管可能還有其它額外的DUOX1胺基酸殘基參與了電子傳遞，NADPH-FAD的距離卻是大於經典的FNR同源蛋白[8]。通過結構比較，作者發現與FNR以及csNOX5的DH相比，DUOX1的催化脫氫酶DH處於一個鬆弛的構象，因此在現有的DUOX1結構中，電子傳遞途徑並非最優的狀態。作者發現在細胞膜上的DUOX1比純化組裝在peptidisc中的樣品具有更高的活力，因此推測細胞膜上的磷脂或者脂雙層環境可能以某種未知的方式影響DUOX1的結構，並增強其電子傳遞效應。
單顆粒重構算法Multibody修正所提供的柔性分析顯示在低鈣狀態下胞內區域顯示了寬的梯形分布，這與在高鈣狀態下的近似正態分布形成了鮮明對比。這表明在低鈣狀態下胞內區具有更大的不穩定性。作者比較了高鈣和低鈣兩個狀態下的結構，發現鈣引起的構象變化主要發生在胞內區的調控結構域：在低鈣條件下，EF-hand調控元件呈延伸的形狀；EF2遠離催化DH結構域；PHLD遠離TMD和DH結構域。這些結構改變使得DH與TMD的相互作用變弱，進而導致DH處於更靈活的狀態。作者推測DH的高靈活性降低了電子傳遞的有效性和NADPH的親和力，進而降低了DUOX的催化活力。
圖2：DUOX1的電子傳遞途徑以及可能的鈣激活機制
綜上所述，本項研究解析了在高鈣和低鈣兩種狀態下人源DUOX1-DUOXA1在peptidisc中穩定的異源四聚體複合物的高分辨結構，觀測到了高鈣狀態下DUOX1多個胞內結構域間的相互作用以及不同鈣離子濃度下胞內調控結構域的構象變化，為深入理解DUOX以及其他NOX家族蛋白酶的結構以及活力調控機制奠定了基礎。
本項研究主要由北京大學未來技術學院分子醫學所博士後吳驚香完成，博士生劉銳和宋康成參與了部分實驗，陳雷研究員為通訊作者。本工作獲得科技部重點研發計劃、國家自然科學基金委、生命科學聯合中心等經費支持。博士後吳驚香獲得了CLS博士後獎學金、北京大學博雅博士後獎學金、國家自然科學基金及中國博士後科學基金的支持。該工作的冷凍電鏡樣品製備、篩選和採集在北京大學冷凍電鏡平臺和北京大學電鏡室完成，得到了李雪梅、郭振璽、邵博、裴霞和王國鵬等人的幫助。該項目的數據處理獲得了北京大學CLS計算平臺及未名超算平臺的硬體和技術支持。
陳雷實驗室主要研究膜蛋白特別是與代謝類疾病和心血管疾病相關的重要膜蛋白的工作機制（http://www.imm.pku.edu.cn/kytd/rcdw/34142.htm）。該實驗室開展了對KATP通道[9-11]，TRPC通道[12]，OSCA通道[13]，sGC[14]，SOAT (ACAT) [15]，以及鈉通道NALCN複合體[16]等重要蛋白質的機制研究。陳雷實驗室長期招聘博士後，希望有生物化學、電生理、抗體製備或結構生物學背景的博士加入該實驗室。
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