北京大學高寧研究組發表一篇Nature―高校科技―中國教育和科研...

　　2018年7月4日，北京大學生命科學學院、北京大學-清華大學生命科學聯合中心高寧教授課題組與香港科技大學戴碧瓘教授課題組合作，在《自然》（Nature）雜誌以長文形式發表題為「Structure of the origin recognition complex bound to DNA replication origin」的研究論文，報導了結合有複製起點DNA（ARS305）的釀酒酵母起點識別複合物（ORC）3-解析度的冷凍電鏡結構。此高解析度結構不僅為理解酵母ORC如何識別和結合序列特異性的DNA複製起點提供了分子基礎，同時也闡明了ORC如何通過彎曲DNA來進一步加載DNA複製解旋酶MCM2-7的分子過程。

　　DNA複製起始在真核生物細胞體中受到嚴格精密調控。DNA複製啟動因子首先結合到DNA複製起點，以加載DNA複製解旋酶MCM2-7複合物到DNA上，隨後MCM2-7被激活，DNA雙鏈被解螺旋，從而啟動DNA複製。真核生物的複製啟動因子ORC由六個亞基組成。所有真核生物都是利用ORC來標記DNA複製起始的位點。除了在基因組穩定性以及腫瘤的發生發展中顯而易見的重要作用，人源 ORC複合物的多個亞基（包括ORC1，ORC4，ORC6，Cdc6）的功能缺失突變都和一類罕見遺傳發育疾病直接相關（Meier-Gorlin syndrome，MGS）。MGS患者在胚胎期生長遲緩並伴隨多種發育畸形，出生後發育也嚴重受阻並導致身材矮小、小耳症、膝蓋骨缺失等。

　　雖然在不同的真核生物中，ORC的蛋白質序列高度保守，但是ORC對DNA複製起點序列的選擇性在不同物種間差別很大。釀酒酵母的ORC可以識別特異的DNA複製起點，而人源細胞的ORC結合的DNA序列卻沒有序列特異性，主要依賴染色體結構識別複製起點。ORC序列識別差異背後的分子機制，也一直是個未解之謎。造成這種局面的一個很大的原因，就是多年來一直缺少ORC結合DNA的高分辨結構。已經發表的關於ORC結構中，要麼複合物中沒有DNA，要麼解析度較低，不足以提供足夠的細節信息，我們仍然無法推測ORC與DNA是如何相互作用從而實現其功能的。為了解開這個謎團，高寧課題組和戴碧瓘課題組克服一些技術難題，合作解析了釀酒酵母ORC結合DNA複製起始位點3-解析度的冷凍電鏡結構。

　　（a）ORC-起點DNA複合物冷凍電鏡結構；（b）複合物結構中DNA在ACS以B1區域的兩次彎曲

　　本文解析的ORC-ARS305 DNA複合物結構中，ARS305包含一段ARS高度保守序列（ARS consensus sequence， ACS）和一段B1元件序列，長度為72 bp。在這個結構中，ORC的六個亞基通過與磷酸骨架的非特異性以及與鹼基的特異性相互作用環繞DNA，並在ACS和B1位點使DNA發生彎曲。該結構的一個關鍵特徵是Orc1的保守鹼性胺基酸區域（Orc1-BP，basic patch）深深地插入ACS的小溝中進行序列特異的鹼基識別。另外，酵母特有的具有物種特異性的位於Orc4 Wing Helix結構域（WHD）中的Helix Insertion（Orc4-IH）嵌入ACS的大溝中，與相應的鹼基形成疏水相互作用。重要的是，在ACS區域形成的這些鹼基特異的相互作用的鹼基都非常保守。此外，在B1區域中，也有類似的來自Orc2和Orc5的鹼性胺基酸區域插入到大溝和小溝中，與鹼基相互作用，並使DNA彎曲。因此，釀酒酵母ORC高度序列特異性主要是通過ORC亞基的大溝、小溝插入基序與ACS保守鹼基之間的特異性相互作用實現的。序列比對分析顯示，所有真核生物Orc1的N端都具有類似釀酒酵母的Orc1-BP；然而Orc4-IH卻只在釀酒酵母中存在。這些發現，很大程度上解釋了不同物種ORC識別起始DNA特異性差異背後的原因。

　　高寧以及戴碧瓘、香港科技大學翟元樑博士（現為香港大學助理教授）為本文的共同通訊作者。高寧組的博士後李寧寧、博士生程稼萱以及戴碧瓘組的博士後林偉熙、翟元樑為本文的共同第一作者。高寧組的成二超（2017年已博士畢業）和戴碧瓘組的博士趙永倩參與了研究工作。冷凍電鏡數據收集工作主要在北京大學電子顯微鏡實驗室（冷凍電鏡平臺）完成，平臺的李雪梅老師和物理學院的餘大啟博士在數據收集過程中提供幫助；國家蛋白質科學（北京）設施清華大學冷凍電鏡平臺為本課題的早期研究提供支持。冷凍電鏡數據處理主要在北京大學高性能計算中心完成，平臺主管樊春老師亦提供幫助。本論文得到科技部、國家自然科學基金委、香港研究資助局、中國博士後基金的經費支持。李寧寧獲得北京大學-清華大學生命科學聯合中心優秀博士後基金的資助。

　　高寧課題組和戴碧瓘課題組從2013年開始合作，在真核生物DNA複製起始調控機制的研究方面取得了很好的成果。他們先後解析了酵母DNA複製解旋酶雙六聚體複合物Mcm2-7的3.8-的冷凍電鏡結構（Nature，2015）以及解旋酶加載到DNA前游離的Mcm2-7六聚體和Cdt1-Mcm2-7七聚體複合物的結構（Nat Struct&Mol Biol， 2017）。

　　值得一提的是，這是北京大學冷凍電鏡平臺自2017年秋季正式運行以來，其產出的研究成果首次在國際頂級期刊上發表。ORC-DNA複合物的分子量為400kD左右，顆粒較小，解析度可以達到3？，這表明北京大學冷凍電鏡平臺的硬體建設的初步目標已經圓滿達成。