「綜述」中性粒細胞胞外陷阱是重症哮喘潛在的治療靶標

文章來源：中華結核和呼吸雜誌, 2020,43(11) : 958-962

DOI：10.3760/cma.j.cn112147-20200209-00067

作者：解立旭 葛林陽 陳子 周林福

單位：南京醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重症醫學科

摘要

難治性哮喘（重症哮喘）仍是臨床治療的瓶頸。中性粒細胞募集和浸潤參與重症哮喘和激素抵抗的發生發展。中性粒細胞胞外陷阱（NET）是中性粒細胞激活後釋放到胞外的網狀超微結構。現有證據表明，NET具有抗感染和促炎的雙刃劍作用，與重症哮喘密切相關。靶向NET或NET組分有望成為治療重症哮喘等中性粒細胞炎症性疾病的潛在靶標。

中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NET）是中性粒細胞激活後釋放到胞外的網狀超微結構，在固有免疫和適應性免疫中起重要作用。NET最初被識別為一種新的抗菌機制。越來越多的研究發現，NET可介導自身組織超炎症病理改變^［1］。目前，難治性哮喘（重症哮喘）仍是臨床治療的瓶頸。近來研究表明，重症哮喘患者體內高表達NET^［2］，而且NET與哮喘控制水平呈負相關^［3］。對於糖皮質激素依賴或抵抗型重症哮喘患者，亟需深入探討發病機制及其治療策略。以NET或NET組分作為分子靶標，有望為治療中性粒細胞炎症性疾病帶來新的前景。本文將就NET生物學特性、NET在重症哮喘發病機制中的作用以及靶向NET治療重症哮喘的價值做一綜述。

一、NET生物學特性

作為一種新型抗菌防禦系統，NET可阻礙病原菌擴散^［4］。不過，NET及組分對宿主細胞具有毒性作用，並能夠激活自身免疫^［1］。總的說來，NET是一把雙刃劍，既可作為固有免疫的一道防線，也可體內蓄積並造成自身組織損傷。

NET具有獨特的超微結構，骨架由直徑15~17 nm的染色質細絲組成，骨架上鑲嵌直徑約50 nm球狀結構。染色質細絲由DNA和組蛋白組成。球狀結構由中性粒細胞的初級和次級顆粒組成，例如中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）、髓過氧化物酶（MPO）、組織蛋白酶G、蛋白酶3、α-防禦素、乳鐵蛋白。在三級顆粒中，NET包含基質金屬蛋白酶9（MMP-9）和肽聚糖識別蛋白S。

NET形成是一個漸進式過程：（1）活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生；（2）彈性蛋白酶和髓過氧化物酶轉運至細胞核；（3）組蛋白修飾；（4）細胞質膜破裂和染色質釋放。現認為，ROS在NET形成的信號通路中不可或缺^［5］。慢性肉芽腫性疾病患者還原型輔酶Ⅱ（NADPH）過氧化酶亞基突變導致合成ROS障礙，患者中性粒細胞不能形成NET，於是出現反覆感染^［6］。在慢性肉芽腫性疾病患者的中性粒細胞中加入過氧化氫，即可恢復NET形成的能力。染色質修飾需要蛋白質精氨酸脫氨酶4（PAD4）驅動的組蛋白脫氨基或瓜氨酸化^［7］。

NET形成意味著機體可能面臨著某種問題（例如病原微生物入侵），此時NET發揮了積極作用。然而，NET及組分具有強烈的生物學效應。業已證實，NET參與呼吸系統多種疾病的發生發展，包括慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）、哮喘、急性肺損傷、腫瘤等^［8］。穩定期慢阻肺患者NET與氣流受限嚴重程度相關，急性加重期慢阻肺患者NET濃度與急性加重頻率、FEV₁和疾病嚴重程度相關^［9］。NET能促進癌細胞附著血管壁，導致腫瘤遷移增強。NET還參與系統性紅斑狼瘡（SLE）、風溼性關節炎和血管炎等免疫性疾病的病理生理^{［10, 11, 12］}。

二、重症哮喘發病機制及治療現狀

氣道炎症、氣道高反應性和氣道重塑是哮喘顯著的臨床特徵。採用吸入糖皮質激素（ICS）/長效β2受體激動劑（LABA）維持緩解策略，可使86.5%的哮喘患者實現臨床控制^［13］。約5%~10%哮喘患者即使長期應用ICS/LABA，仍出現不可逆性氣流阻塞，需反覆急診就醫和住院治療。全球哮喘防治創議（GINA）將經過第4步治療（緩解藥物加2種或更多的控制藥物）尚未達到可控制水平的哮喘，稱為重症哮喘。重症哮喘急診就醫率和住院率分別為輕、中度哮喘的15倍和20倍。顯然，亟需闡明重症哮喘的發病機制，並據此研發新的精準治療方法。

重症哮喘根據氣道炎症病理表型，可分為嗜酸粒細胞型、中性粒細胞型和少炎症細胞型。其中，嗜酸粒細胞型主要緣於患者對糖皮質激素治療不敏感，或胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）誘導的Ⅱ型固有淋巴細胞（ILC2）激活對激素治療產生抵抗性^［14］。重症哮喘患者即使應用激素治療，支氣管肺泡灌洗液（BALF）仍高表達IL-33和TSLP^［14］，故TSLP可能是重症哮喘潛在的生物標誌物^［15］。中性粒細胞型表現為氣道瀰漫性中性粒細胞浸潤，非Th2細胞因子（IL-17A、IFN-γ和IL-8）水平升高，伴氣道高反應性和氣道平滑肌增生^{［16, 17］}。少炎症細胞型較少見，患者以氣道平滑肌異常增生為特徵，無顯著氣道炎症。

重症哮喘是一種異質性疾病，存在不同的表型和內型，尤其中性粒細胞型重症哮喘仍無特異性治療藥物。研發基於生物標記物的人源治療性抗體已成為全球關注的熱點。奧馬珠單抗（Omalizumab）是一種人源化重組鼠抗人的抗IgE單抗，可改善重症哮喘患者症狀，減少糖皮質激素用量和急性加重，提高患者生活質量^［18］。全人源抗IL-5抗體（Mepolizumab和Reslizumab）和抗IL-5受體抗體（Benralizumab）已用於治療高嗜酸粒細胞型重症哮喘^［19］。全人源抗IL-4單抗（Dupilumab）及抗IL-13抗體（Tralokinumab和Lebrikizumab）已進入Ⅲ期臨床試驗。抗IL-17單抗（Brodalumab）處於Ⅱ期臨床試驗^［20］。使用人源化TSLP IgG2泰澤培單抗（TZEP）治療超過12個月，重症哮喘患者可顯著臨床獲益，包括改善肺功能和減少急性加重頻率^{［15， 21］}。

三、中性粒細胞促進激素抵抗性哮喘

氣道中性粒細胞大量募集浸潤和活性增強是重症哮喘的「元兇」，但其潛在的發病機制未明，也無有效的藥物控制。現有研究表明，IL-17、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和IL-8等細胞因子可能與激素抵抗性哮喘密切相關。重症哮喘患者外周血IL-17A和BALF中TNF-α水平增高^{［16， 22］}。將Th17細胞過繼免疫缺陷小鼠，隨後抗原誘導氣道炎症，結果發現氣道CXC趨化因子和中性粒細胞浸潤增加，但不能被地塞米松逆轉^［23］。相反，Th2細胞過繼可導致小鼠氣道嗜酸粒細胞驟增，並且地塞米松顯著抑制氣道炎症。據此推測，Th17細胞產生的IL-17可介導中性粒細胞向肺內募集，引起激素抵抗性哮喘。採用卵蛋白（OVA）和佐劑誘導中性粒細胞性激素抵抗型哮喘表型，可見肺組織TNF-α表達上調^［24］。而且，抗TNF-α抗體可恢復該模型的激素敏感性，說明TNF-α可能降低了中性粒細胞氣道炎症對激素的治療反應。聯合塵蟎、豚草和麴黴所建立的小鼠中性粒細胞氣道炎症，與核因子NF-κB介導的角質形成細胞衍生趨化因子（人IL-8的一種功能同源物）有關。NF-κB抑制劑能夠抑制IL-8水平，而地塞米松則不然，這表明IL-8在激素抵抗性哮喘氣道中性粒細胞募集中起重要作用^［25］。

四、NET在重症哮喘發病中的作用

NET不僅參與清除病原體，還會加重氣道疾病。NET與慢性氣道炎症性疾病（如哮喘和慢阻肺）關聯^［26］，特別是重症哮喘（圖1）。中性粒細胞自噬還能調節NET形成。新近研究證實，失去細胞核的中性粒細胞細胞質可能參與了激素抵抗性哮喘的病理生理過程^［27］。

圖1NET在重症哮喘中的作用。吸入變應原（病原微生物、汙染物等）激活抗原遞呈細胞。上皮細胞分泌胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP），激活樹突狀細胞（DC）並驅動Th0分化為Th2細胞，還通過Ⅱ型固有淋巴細胞（ILC2）激活肥大細胞，協同IL-25和IL-33，促進產生Th2細胞因子。IL-6和IL-12誘導Th0分化為Th1或Th17細胞，產生IL-17和IFN-γ等炎症因子，募集中性粒細胞至肺組織。中性粒細胞脫顆粒，產生基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、彈性蛋白酶（NE）和轉化生長因子β（TGF-β），促進氣道高反應性和氣道重塑，並產生活性氧（ROS）。MMP-9誘導樹突狀細胞遷移和分化成熟，NE誘導杯狀細胞分泌黏液，兩者負調控基質金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1），加重肺組織損傷。中性粒細胞通過形成NET，釋放dsDNA或NE等組分，導致氣道上皮細胞損傷或死亡

1. NET促進氣道中性粒細胞募集：與非中性粒細胞性哮喘患者比較，中性粒細胞性哮喘患者體內NET、胞外DNA（eDNA）和抗菌肽LL-37均顯著增高^［28］。而且，重症哮喘患者誘導痰eDNA水平顯著高於輕中度哮喘患者。誘導痰eDNA水平與CXCL8和IL-1β呈正相關，與患者肺功能和哮喘控制水平呈負相關^［28］。這表明患者NET、eDNA和抗菌蛋白LL-37氣道積聚，與中性粒細胞募集、哮喘嚴重程度和肺功能惡化有關。

2. NET誘導上皮源性細胞因子：哮喘氣道嗜酸粒細胞激活涉及兩種主要途徑，即Th2和固有免疫-ILC2介導的免疫應答，其中固有免疫-ILC2免疫應答參與形成激素抵抗性哮喘^［14］。NET誘導上皮細胞分泌內源性CXCL-8、IL-1β^［28］，促進氣道上皮細胞產生IL-25、IL-33和TSLP等多種細胞因子，繼而激活ILC2，產生Th2細胞因子，導致嗜酸粒細胞持續增多和激素抵抗。重症哮喘患者外周血嗜酸粒細胞胞外陷阱（eosinophil extracellular traps，EET）和ILC2數量顯著升高，且兩者呈正相關^［29］。將EET注射到小鼠體內，上皮源性細胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-33和TSLP）、BALF中嗜酸粒細胞以及肺組織ILC2數量顯著增加^［29］。這表明EET可通過激活氣道上皮細胞和ILC2，增強重症哮喘氣道Th2優勢免疫。或許，NET也有EET樣功能，共同促進重症哮喘的發生發展。

3. NET蘊含幾十種顆粒酶：鼻病毒刺激宿主釋放雙鏈DNA（dsDNA）和彈性蛋白酶，並誘發哮喘急性加重。此時，哮喘急性加重患者dsDNA水平不僅與BALF彈性蛋白酶相關，而且與鼻腔灌洗液和BALF中Th2細胞因子及哮喘嚴重程度相關^［30］。鼻病毒感染可促進哮喘小鼠NET形成並釋放dsDNA，體內注射dsDNA則再現鼻病毒誘導哮喘急性加重的典型特徵^［30］。顯然，肺組織NET大量積累是鼻病毒誘導哮喘急性加重的關鍵環節。在OVA致敏模型中，MMP-9基因敲除小鼠樹突狀細胞的遷移和分化成熟受抑，氣道炎症和氣道高反應性降低，Th2細胞因子和OVA特異性IgE減少^［31］。長期暴露於中性粒細胞彈性蛋白酶，會出現杯狀細胞化生和肺嗜酸粒細胞炎症。吸入彈性蛋白酶可引起Muc5ac蛋白高表達和杯狀細胞化生，BALF角質形成細胞衍生趨化因子/IL-8和IL-5水平增多，肺組織炎症細胞浸潤增多^［32］。

4. 中性粒細胞自噬參與NET形成：自噬指在飢餓和細胞應激期間消除受損細胞器或蛋白質，藉以維持細胞存活。自噬相關基因5/7多態性與哮喘相關。與非重症哮喘患者相比，重症哮喘患者誘導痰和外周血細胞自噬水平增加^［33］。在體外，IL-5刺激可提高重症哮喘患者外周血嗜酸粒細胞的自噬水平，而且不受地塞米松影響^［33］，說明自噬在重症哮喘中扮演重要角色。實際上，自噬參與NET形成和釋放^［34］。重症哮喘患者外周血NET與中性粒細胞自噬水平呈正相關^［3］。與非重症哮喘患者相比，重症哮喘患者外周血NET和中性粒細胞自噬水平增高。IL-8非但增加重症哮喘患者自噬和NET水平，而且IL-8誘導的NET水平與FEV₁/FVC呈負相關。換言之，中性粒細胞自噬與NET相關聯，在炎症因子協同下，增強哮喘的嚴重程度^［3］。加之，嗜酸粒細胞自噬誘導EET形成^［35］。由此可見，調節中性粒細胞自噬和NET或嗜酸粒細胞自噬和EET，可能是治療重症哮喘的新靶標。

5. NET破壞氣道上皮細胞和肺泡內皮細胞：體外研究顯示，NET可直接殺死肺泡上皮細胞和內皮細胞，產生毒性作用，並呈劑量依賴性。其中，組蛋白是造成細胞毒性作用的重要因素^［36］。重症哮喘患者分離的NET不僅誘導氣道上皮細胞脫落、死亡，而且增加氣道上皮細胞分泌炎症因子，例如IL-6和IL-8^{［2, 3］}。急性肺損傷以中性粒細胞浸潤為主，肺組織產生大量NET，誘導肺泡損傷和上皮細胞死亡。這揭示NET加重哮喘的嚴重程度，參與重症哮喘的發生發展。

6. 失去細胞核的中性粒細胞細胞質誘導Th17介導的中性粒細胞炎症：空氣過敏原和脂多糖致敏小鼠的NET形成增多，肺組織無細胞核的中性粒細胞細胞質也顯著增多。PAD4基因敲除小鼠哮喘模型過敏性氣道中性粒細胞炎症減少，NET、無細胞核的中性粒細胞細胞質和氣道高反應性顯著降低。然而，通過注入脫氧核糖核酸酶（DNase）降解NET，並不引起中性粒細胞減少。另外，中性粒細胞細胞質可體外激活肺樹突狀細胞，誘導Th0細胞產生抗原特異性IL-17。其實，中性粒細胞增高的重症哮喘患者NET和中性粒細胞細胞質均增高，兩者與肺組織IL-17水平呈正相關^［27］。因此，NET和中性粒細胞細胞質可能皆參與了IL-17介導的激素抵抗性哮喘。

五、靶向NET治療重症哮喘的策略

雖然吸入糖皮質激素抑制氣道炎症是哮喘治療的基石，但重症哮喘患者對激素治療反應較差。隨著糖生物學和納米技術的突飛猛進，靶向治療已成為國內外學者關注的熱點。通過阻斷NET形成，或者通過DNase酶降解NET，可用來治療NET水平過高所致的相關疾病，例如急性肺損傷和病毒誘導的哮喘急性加重等。利用現代生物技術，製備針對NET或者NET組分的特異性配體，有助於治療中性粒細胞炎症性疾病。

1. 靶向NET組分的特異性抗體：鼻病毒感染的哮喘小鼠體內注射彈性蛋白酶抑制劑，可減少NET形成，抑制Th2免疫、黏液高分泌和氣道高反應性^［30］。應用髓過氧化物酶抑制劑可減少NET對氣道上皮細胞的毒性作用^［36］。從重症哮喘患者分離的NET可刺激上皮細胞並引起細胞死亡，抗髓過氧化物酶抗體或抗彈性蛋白酶抗體預處理NET可減少細胞死亡，但地塞米松預處理NET反而加重NET的毒性作用^［3］。毋庸置疑，對於NET增高為主的重症哮喘，針對NET組分的特異性抗體靶向治療可能更加合適。

2. 阻斷NET形成的條件：例如，ROS、自噬和PAD4已成為治療NET相關疾病的靶標。體外研究顯示，ROS阻斷劑可減少哮喘患者產生EET，而地塞米松不能抑制EET^［37］。自噬抑制劑可減少哮喘小鼠氣道EET形成、杯狀細胞增生、炎症因子釋放和NF-κB表達^［35］。應用基因沉默技術敲除PAD4基因，通過阻斷NET形成，可抑制中性粒細胞募集和氣道高反應性^［27］。因此，自噬抑制劑、ROS阻斷劑甚至PAD4基因沉默技術，乃是重症哮喘潛在的替代治療方案。

3. 靶向唾液酸結合的免疫球蛋白樣凝集素9（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 9，Siglec-9）：Siglec-9特異性表達於中性粒細胞表面，可誘導中性粒細胞發生程序性細胞死亡（凋亡或自噬），有助於促進中性粒細胞炎症消退^［38］。A型鏈球菌表面高分子量透明質酸（HMW-HA）與中性粒細胞Siglec-9特異性結合，可抑制ROS和NET形成，從而逃逸中性粒細胞清除^［39］。深入研究Th17細胞介導的中性粒細胞性激素抵抗機制，研發以Siglec-9為靶標的特異性配體、抗體或小分子化合物，有望為治療中性粒細胞型重症哮喘帶來新的前景^［40］。

4. DNase降解已經形成的NET：體外研究證實，DNase可減輕NET對氣道上皮細胞的損傷，這提示吸入Dnase有益於治療NET介導的重症哮喘^［2］。Dnase既能抑制氣道NET，又能抑制EET^［41］。DNase可顯著抑制OVA致敏的急性哮喘小鼠EET形成，降低氣道高反應性，抑制杯狀細胞增生^［41］。囊性纖維化患者應用黏液溶解劑DNase，可減輕氣道炎症和黏液高分泌，改善近期肺功能，並延緩遠期肺功能下降速度^［42］。

六、總結與展望

中性粒細胞浸潤與重症哮喘或激素抵抗型哮喘相關聯。嗜酸粒細胞和中性粒細胞混合炎症可能是重症哮喘重要的病理特徵及生物標誌物。IL-17、TNF-α和IL-8等細胞因子可能與激素抵抗性哮喘的發病有關。NET具有抗感染和促炎的雙重特性。NET及中性粒細胞胞質可能皆參與了IL-17介導的激素抵抗性哮喘的發生發展。抑制NET形成對鼻病毒誘導的哮喘急性加重有保護作用。DNase或NET組分抑制劑可減少NET形成或降解NET，改善重症哮喘症狀、肺功能和急性加重。今後，深入剖析NET超微結構和功能、Siglec-9糖生物學以及Th17細胞和中性粒細胞之間的交互作用，研發以NET為靶點的小分子化合物或特異性配體，有望為治療重症哮喘、慢性阻塞性肺疾病等中性粒細胞炎症性疾病帶來新的願景^{［2， 40］}。

參考文獻：略