通過農桿菌對植物細胞進行轉基因操作的研究進展

摘要：農桿菌是一種革蘭氏陰性菌，在自然條件下就可以對植物進行侵染，這主導得益於其含有的Ti質粒，這種方法又稱為農桿菌介導法。本文通過對農桿菌介導法對植物細胞的侵染作用的機制，農桿菌侵染的分子機理以及此方法的應用進行介紹，並對此方法進行相關展望。

1.1 農桿菌介導法介紹

農桿菌是普遍存在於土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位 [1]，並誘導產生冠癭瘤或髮狀根。根癌農桿菌和髮根農桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，藉助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然後通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株
從Hinchee等 (1988) 第一次應用農桿菌介導法轉化了大豆, 作物轉基因技術已經經過了30年的發展, 提高作物轉基因效率一直是轉基因研究的關鍵點[2]。農桿菌Ti質粒的T-DNA可高效率地整合到植物受體細胞的染色體上並得到表達。利用這一特點，Marton等(1979)以植物原生質體為受體首創了「共培養法」。後來經過一系列改進，特別是Horsch等(1985)建立的「葉盤共培養法」，使這種轉化方法更加實用。農桿菌介導法起初只被用於雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物(尤其是水稻)中也得到了廣泛應用。

1.2  Ti質粒介紹

而致瘤質粒 (tumor-inducing plasmid, 簡稱為Ti質粒) 是根癌農桿菌細胞擬核區外分離到的一種能自主複製的雙鏈環狀DNA分子, 長度約為200~250 Kb。Ti質粒可以誘導植物細胞產生不同種類的冠癭鹼, 根據產生冠癭鹼的類型, Ti質粒可以分為4類:章魚鹼型、胭脂鹼型、農杆鹼型和琥珀鹼型。[3]從結構上看, Ti質粒包括T-DNA區、毒性區、接合轉移區和複製起始區4部分。其中, T-DNA區和毒性區參與了外源基因的轉移整合,其結構特點如下: (1) T-DNA區。該區是根癌農桿菌侵染植物細胞時, Ti質粒在相關蛋白的作用下被切割下來整合至植物基因組的一段DNA分子。該區段分布一些與激素合成相關的基因,其表達產物能引|起植物細胞激素紊亂,進而導致腫瘤的形成。因為Ti質粒類型不同，T-DNA長度也有所不同,總體介於12~24 Kb之間。其最重要的區域是分別位於左右兩端邊界處25bp的重複序列,兩者在T-DNA轉移外源基因整合至植物基因組中發揮功能,其中右邊界序列的作用更為重要。(2) 毒性區(Vir區)。該區是位於T-DNA以外的一段DNA分子,長度介於30~40 Kb之間。不同類型的Ti質粒Vir區結構也有所不同,以胭脂鹼型Ti質粒為例,其Vir區有7個操縱子。這些基因編碼的蛋白質在T-DNA轉移整合中起輔助作用，其本身不會與植物基因組整合[4]。

在過去的幾十年間，關於根癌農桿菌轉化植物細胞的分子機製得到了廣泛研究。目前,人們普遍認同Ti質粒轉化過程可分為8個相互關聯的階段[5],分別為:(1)當植物受到創傷後，會分泌酚類化合物,吸弓|農桿菌移向植物細胞,然後與植物細胞相關受體蛋白特異性結合; (2) Vir A蛋白是位於細菌細胞膜上能識別植物酚類化合物的受體蛋白，兩者結合後引|發Vir G蛋白的磷酸化; (3)由於Vir G蛋白磷酸化,使其從非活性狀態轉變至活性狀態,並作為激活因子結合至其他Vir基因的啟動子上,開啟Vir基因表達; (4) Vir D1和Vir D2蛋白作用於T-DNA的底鏈上,將其切割形成單鏈T-DNA分子(即T-strand) ;同時Vir D2蛋白以共價方式連接在T-strand的5'端,形成一個不成熟T鏈 複合物; (5) Vir D4和Vir B類蛋白結合形成具有轉運功能的通道,協助不成熟T鏈複合物和一些Vir蛋白進入植物細胞中; (6)在轉運途中, Vir E2蛋白包被在不成熟T鏈複合物上，構成成熟T鏈複合物; (7)成熟T鏈複合物和一些植物細胞蛋白(Ran、VIP1等) 進-步識別結合，協助T鏈複合物經核孔到達細胞核; (8)在Vir D2、Vir E2和植物細胞相關蛋白的協助下，T-strand與植物細胞基因組完成整合。實驗操作步驟：1.首先獲取目的基因2.用限制酶切割下目的基因3.基因表達載體的構建。將目的基因與載體(大多數選用質粒)用DNA連接酶連接起來。將目的基因導入受體細胞。將含目的基因的重組質粒導入農桿菌(農桿菌為受體細胞)。目的基因的檢測與鑑定。用DNA分子雜交技術/分子雜交技術/抗原一抗體雜交/個體生物學幾種方法進行檢驗(根據要求選取不同方法)。最後將成功表達的細胞導入植物體內，對植物體進行個體生物學水平鑑定。

農桿菌介導的瞬時表達提供了一種快速分析基因型功能的方法，該方法是Rossi等在1993年創建的。他們將帶有重組質粒的農桿菌，經誘導後通過抽真空滲透入植物葉片進而滲透入植物細胞，通過目的基因瞬時表達來檢測植物中農桿菌介導的T-DNA轉移的效率。隨後人們又採用針管注射活體植株葉片，來進行農桿菌介導的基因瞬時表達檢測。近幾年該項技術不斷完善、發展，已被廣泛用於外源基因表達分析、無毒基因與抗性基因的相互作用、基因沉默、啟動子分析等許多植物分子生物學領域。[6]常用的植物瞬時表達的侵染技術主要有葉片注射法和真空侵染技術等。Li[7]等人把人乳鐵蛋白N端重組到 PVX載體，並用葉片注射法在菸草中成功表達，目的蛋白表達量可達到總可溶蛋白的0.6％。Ramrez[8]等利用真空侵染法在菸草中成功的表達了B型肝炎表面抗原的單鏈抗體。此方法的主要原理：是將目的基因插入共整合載體或雙元載體,轉化根癌農桿菌,後者經酚類化合物誘導處理後，通過真空滲透或針管注射入植物葉片組織中,農桿菌在葉片內與植物細胞緊密接觸。誘導處理在轉錄水平激活Vir區基因,真空滲透或注射使得農桿菌與植株葉片細胞接觸,從而實現了T-DNA轉移進入植物細胞核。大部分T-DNA並未整合入植物基因組而是暫時存在於核內並在植物細胞轉錄、翻譯成分的協助下瞬時表達T-DNA基因,通常在數小時後即可檢測到外源基因的表達,並在1~2 d內達到最高值。而少量整合進植物染色體的T-DNA在瞬時表達中不起作用或極為微弱[9]該技術主要包括載體的構建、農桿菌的培養及誘導、真空滲透或針管注射3個主要步驟:(1)將目的基因插入共整合載體或雙元載體,如pBI121、pMOG800、pBIN91、pTJK136等;轉化農桿菌,如LBA4404、EHA105、C5851等;(2)農桿菌的培養及誘導,將農桿菌培養液按1%(v/v)轉接於含抗生素、2-(N-嗎啉)-乙基磺酸(MES)和乙醯丁香酮(AS)的液體培養基中,振蕩培養至對數生長期,離心收集菌體,重懸於MMA溶液(含Mg、Cl2、MES、AS)中,並調整菌液濃度使其0D（600）=1.5左右,室溫靜置3h;(3)真空滲透或針管注射,真空滲透法一般是將離體葉片浸入菌液中,抽真空一定時間並迅速釋放使得菌液滲入葉片內,把處理後的葉片放入盛有用無菌水或MS培養液浸溼的濾紙的培養皿中,培養一段時間後取樣檢測。[6]植物基因瞬時表達目前主要應用在1.外源基因表達分析[10]2.啟動子對基因表達調控的研究[11]3.基因沉默研究中的應用[12]4.宿主抗性與病原物無毒基因的相互作用研究[13]

農桿菌介導法實際上就是根癌農桿菌和髮根農桿菌細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒,其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後,可將T-DNA插入到植物基因組中。開始只是對雙子葉植物進行應用，而近些年對於單子葉植物，克服了多種困難，農桿菌介導法也得到了很好的應用。很多重要的單子葉植物，例如水稻，玉米，小麥等重要的糧食作物，通過農桿菌介導法，增加了其抗性。增加了糧食產量，這是一件對於人類糧食產量十分有意義的事情。農桿菌介導的瞬時表達這一方法，大大增加了轉化的效率。目前已被廣泛用於外源基因表達分析、無毒基因與抗性基因的相互作用、基因沉默、啟動子分析等許多植物分子生物學領域相信未來對於農桿菌介導法的研究，會有更多的新興技術產生，會大大增加研究的效率。

[1]馬海燕、袁雪、劉丕慶.農桿菌介導植物原位轉化的研究進展[J]. 分子植物育種. 2019,23,7764-7769

[2]王臣臣、王麗華、劉言龍等.提高作物轉基因效率方法研究進展[J]. 分子植物育種,2019,17(11),3585-3592

[3]李淑萍,康潔.農桿菌Ti質粒的改造及其衍生的質粒載體[J].生物學通報, 2006,41 (5) :19~20

[4]張潔, 周巖.根癌農桿菌轉化單子葉植物的研究進展與對策[J].生物技術通報, 2013,1 (5) :7~14

[5]TZFIRA T, CITOVSKY V..Partners-in-infection:host proteins involved in the transformation of plant cells by Agrobacterium[J].Trends in Cell Biology,2002, 12 (3) :121~129

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[13]Palanichelvam K, Cole A B.Agroinfiltration of cauliflower mosaicvirus gene VI elicits hypersensitive response in Nicotiana species[J].MoI Plant Microbe Interact, 2000,13 (11) :1275-1279.

來源：張宏|圖文

老師：陳德富

編輯：李錦珊  李玉

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指導教師：陳德富

南開大學生命科學學院教授、博士生導師

首屆「談家楨遺傳教育獎」獲得者（2013）

南開大學遺傳學和細胞生物學系主任

南開大學分子遺傳學實驗室PI

南開大學本科生《遺傳學》和《普通生物學》課程負責人

南開大學研究生《現代細胞工程技術》和《分子生物學實驗》課程負責人

天津市科學技術協會委員

天津市生命科學學會聯合體主席團成員、學術諮詢顧問委員會委員

中國遺傳學會常務理事、教學與教育委員會副主任委員、科普專業委員會委員

天津市遺傳學會理事長、支部書記

《遺傳》雜誌優秀編委（2016）