原核表達是指通過基因克隆技術，將外源目的基因，通過構建表達載體並導入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內表達。原核蛋白表達系統是目前最常用、最經濟的蛋白表達方法。大腸桿菌表達系統是應用最廣泛的原核蛋白表達系統之一。一個完整的表達系統通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，融合表達還包括純化系統或者Tag檢測等等。選擇表達系統通常要根據實驗目的來考慮，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產物的純化方法等等。下面介紹下原核表達過程中常見問題。
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Q: 為什麼目的蛋白總是以包涵體形式出現?
A: 在原核表達純化中目的蛋白經常發生錯誤摺疊，並聚集成為包涵體。經過誘導後目的蛋白表達通常可達細胞總蛋白的50%以上，雖然有一定比例的蛋白以可溶形式存在，多達95%的蛋白則存在於包涵體。為了獲得更多可溶蛋白，在實驗過程中，可以降低誘導溫度，例如16-30℃，或降低IPTG濃度（0.01-0.1mM）並延長誘導時間，還可以採用特別的培養基培養細菌。
02
Q: 跨膜蛋白為什麼很難表達?
A: 跨膜蛋白的表達成功率相對較低是一個常見問題，主要原因可能有兩個：
1.跨膜蛋白一般都是強疏水性的胺基酸分子和親水性的分子跳躍式連結，形成的親水疏水的一個最簡單的跨膜化學結構，這種結構和信號肽結構形似。而對於原核細胞來說，簡單的細胞器很難像真核細胞一樣完成信號肽的識別及切除、引導內質網、高爾基體重新包裝及分泌這一複雜過程，有些蛋白多次跨膜，對於原核細胞來說幾乎是不可能完成的任務。
2.對於疏水性片段，在原核細胞表達中非常容易形成包涵體，疏水性多肽會抑制翻譯過程，甚至與原核膜結構融合形成毒性，處於生物自我保護的本能，所有細胞器都會停止合成蛋白的過程。
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Q: 如何選擇蛋白表達宿主菌?
A: 原核表達系統和真核細胞偏愛的密碼子不同，因此，在用原核系統表達真核基因的時候，真核基因中的一些密碼子對於原核細胞來說可能是稀有密碼子，從而導致表達效率和表達水平很低。蛋白表達問題及菌株選擇有以下幾種：
1.無蛋白表達或出現截短蛋白
可能原因是大腸桿菌的密碼子偏移性。需要補充稀有密碼子tRNA,或將稀有密碼子突變為普通大腸桿菌密碼子。
建議表達菌株：Rosetta 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B, RosettaBlue
2.表達為包涵體蛋白
可能原因一是目的蛋白含有二硫鍵，二硫鍵形成困難，可以利用促進二硫鍵形成的各種載體標籤，建議表達菌株是Origami 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B；二是表達過快，表達量過高，可以降低誘導溫度，IPTG濃度優化,建議表達菌株是Tuner, Rosetta-gami B。
3.蛋白無活性
可能原因是蛋白錯誤摺疊。可以利用促進二硫鍵形成的各種載體標籤，建議表達菌株是Origami 2, Rosetta-gami 2, Rosetta-gami B，也可以降低誘導溫度，IPTG濃度優化,建議表達菌株是Tuner, Rosetta-gami B。
4.細胞死亡，生長極困難
可能表達的是毒性蛋白，需要更嚴格的本底表達控制，建議表達菌株pLysS。
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Q: 能不能說一下原核蛋白純化方式及選擇方法
A: 蛋白純化方法常用的有親和純化、離子交換、切膠回收。
1.一般帶有HIS,GST,SUMO,Fc等融合標籤的蛋白，我們可以通過Ni柱、GST柱、protein A等進行親和純化，用親和純化方法一般可以獲得85%以上純度的蛋白，方便快捷。
2.如果不想讓重組蛋白帶有標籤，可以先表達帶標籤重組蛋白，親和純化後用蛋白工具酶切割融合蛋白，再純化除去工具酶。或者直接表達無標籤重組蛋白，進行離子、分子篩、疏水等純化。
3.如果需要表達的蛋白作為抗原，可以直接通過切膠回收的方式，此方法獲得蛋白純度較高，進行免疫後獲得的抗體進行WB實驗，靈敏度較高。
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Q: 獲得的蛋白是有活性的嗎？
A: 要讓原核表達重組蛋白有活性，條件很複雜，合適的緩衝液體系、鹽濃度、蛋白摺疊狀態甚至檢測活性的方法的差別都可能導致蛋白活性差異。一般情況下，上清表達的蛋白要比包涵體經過變復性純化得到的蛋白活性要好，所以我們儘量從上清中獲得蛋白，期許蛋白摺疊達到最接近活性狀態。
Q: 謝謝你，菲小恩。
A: 不用謝！科研好幫手，專業生產商。能夠幫到你是我的榮幸和使命！