本次分享的文章是一篇綜述，匯總了腫瘤相關巨噬細胞在預後、靶向治療和病人治療分層中的重要意義。
摘要
腫瘤組織中存在著大量的巨噬細胞，這些巨噬細胞的形態、定位以及功能活性均存在很大差異。鑑於在多種腫瘤中已經證實巨噬細胞可以在預測腫瘤進展方面起到不小的作用，有望開發基於巨噬細胞的新型預後預測工具。當前研究已經證明了巨噬細胞群體作為一個整體與預後的相關性，但對腫瘤組織中的單核巨噬細胞系統進行亞群分類後，發現具有不同預後意義的不同亞群的巨噬細胞在腫瘤組織中共存。
研究者總結巨噬細胞在人類癌症中發揮預後預測功能的證據，旨在解析巨噬細胞的特徵以及多樣性。大量的新數據將重塑人們對巨噬細胞複雜性的認識，這些新指標有望在未來得到進一步的發掘，為新的預後工具以及治療策略的開發做出貢獻。
正文 1 背景介紹
近年來，有關腫瘤預後標誌物的觀點發生了一些轉變。越來越多的人認識到免疫系統組分和基質介質在腫瘤生物學中扮演了重要角色，這使得研究人員的注意力從傳統的與腫瘤細胞本身的特徵相關的預後因素(腫瘤大小、局部侵襲、淋巴結累及、向遠處器官擴散)轉移到微環境成分以及克隆上的改變。
患者分層對指導癌症患者的臨床管理至關重要，但是同時也是一個需要通過多種臨床變量判斷腫瘤臨床特徵的複雜過程。當採用非傳統或聯合治療方案時，對患者進行分層就顯得尤為重要，因為這些治療方案還沒有收集到大量患者的反饋數據。在這種的背景下，隨著越來越多的證據表明白細胞群對癌症患者的預後有影響，免疫相關指標正在成為一種有應用前景的工具來幫助對患者進行分層。大量的研究已經揭示了特異性免疫參數與腫瘤患者術後臨床轉歸的關係。這些研究主要集中在T細胞上，而對其他類型免疫細胞的研究較少。這些研究通過使研究者們更加重視免疫相關指標在臨床轉歸預測上發揮的作用，從而慢慢地改變現有的腫瘤患者分層方法。並為探索腫瘤微環境中最常見的細胞-巨噬細胞打下了基礎，判斷其是否有潛力進一步完善現有分層體系。
在本文中，研究者回顧了目前現有的對巨噬細胞的了解，並嘗試將其開發為新型的臨床分層工具。
2 巨噬細胞作為預後標誌物以及治療靶點的潛能
巨噬細胞作為免疫細胞的複雜性反映在其促腫瘤和抗腫瘤功能的微妙平衡上。單核吞噬細胞同時是腫瘤微環境中的免疫調節因子、腫瘤治療策略的調節因子和腫瘤免疫治療的潛在靶點。正因如此，它們的臨床相關性不能明確界定，必須逐個病例進行評估。
2.1 巨噬細胞作為預後標誌物
在多種類型腫瘤(乳腺、膀胱、前列腺、頭頸部、膠質瘤、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤)中，高密度的巨噬細胞往往提示不良的預後，這可以由巨噬細胞的促腫瘤功能來解釋。相反，在某些類型的癌症(如結腸直腸癌、胃癌)中，巨噬細胞的高浸潤性與較好的預後相關。
不同部位組織的內在多樣性、巨噬細胞亞型的多樣性以及不同的實驗方法可能導致了這種完全相反的結果。可能是由於不同的研究計算巨噬細胞數量的方法和標準不同，如不同的研究可能計算不同區域（瘤周區域和血管周圍）的Mφ 密度或數量，或者一些研究通過激活或激化標誌只考慮部分巨噬細胞。總的來說，不同的巨噬細胞的類型（亞群）可能與不同的預後相關聯。
近年來，研究者們挖掘了巨噬細胞介導的在常規抗癌治療(如化療和放療)以及免疫和靶向治療中存在的複雜相互作用。這種相互作用可以呈現為促進療效，也可以是抑制療效。此外，巨噬細胞表達檢查點配體，是免疫檢查點抑制劑的的靶點，同時也是用於檢測抗體是否找到靶點的指標。值得注意的是，與巨噬細胞相關的指標已用於建立irPRC(免疫相關病理反應標準)評分系統，該評分系統可用以評估免疫治療效果。
最後，單克隆抗體的靶向治療依賴於巨噬細胞表達的Fc受體的激活，這表明激活的Fc受體的數量可能很重要。總的來說，巨噬細胞的預後指導作用在多種應用場景下存在一定的異質性，取決于于治療策略和腫瘤的類型。但一般來說，吞噬細胞的和密度及其功能狀態可以提示治療策略的療效，並可作為一個預後的預測因素。因而腫瘤微環境中巨噬細胞的豐度可以作為一個重要的預測標誌物，對巨噬細胞密度的預先評估可以為是否進行治療提供依據。
2.2 腫瘤組織中巨噬細胞作為治療靶點
越來越多證據證實了巨噬細胞存在的促腫瘤作用，以巨噬細胞作為治療靶點的策略正逐漸在臨床中應用。這些以巨噬細胞為靶點的治療策略根據其目的（幹擾巨噬細胞的招募，存活或是功能）可以進行分類。
減少腫瘤組織中巨噬細胞的數量有多種方法，例如可以使用二膦酸鹽減少巨噬細胞的數量，例如使用誘導劑阻斷單核細胞從循環系統招募到腫瘤組織來（阻斷招募）。
抗CCR2抗體和小分子抑制劑證明在實驗動物中有效，但是其在腫瘤患者的應用中尚未得到足夠多的結果來下結論。針對巨噬細胞的靶向治療也可以通過阻斷CSF-1受體從而達到對調控巨噬細胞分化和存活的主要調控因子的抑制，或是應用帶有巨噬細胞靶向性的化療藥物如曲貝替定。新方法如重編程巨噬細胞，將其促腫瘤作用轉變為抑制腫瘤作用也正受到越來越多的關注。在這之中，例如激動性CD40單克隆抗體已被證明可以刺激巨噬細胞向抗腫瘤方向轉化。而抑制腫瘤細胞的表面分子CD47的抗體會干擾CD47/SIRPa軸，抑制巨噬細胞的吞噬作用（抑制促腫瘤效應）。幾種CD47-SIRP的血清軸抑制劑目前正在臨床試驗中，評估顯示結果良好。單克隆抗體Canakinuma最初被設計用於炎症條件（如類風溼關節炎或自身炎症症候群）下，該抗體對炎症細胞因子白介素1具有藥理學上的靶向性，在小鼠中應用後顯示瘤體縮小。這一效應可能依賴於作用於腫瘤組織中浸潤的巨噬細胞，該抗體的抗腫瘤效應在人體實驗中也得到了驗證，應用該抗體的病人群體肺癌發生率下降。這也更加使研究者確信炎症相關細胞（例如巨噬細胞）在腫瘤發生發展中起到了一定促進作用。
3 評估腫瘤組織中的巨噬細胞特徵以進行病人分層
以免疫學變量作為病人預後轉歸的標誌物的研究，主要探討該變量能否在特定的臨床應用場景中定量評估與之相關的免疫系統成分。
比如Immunoscore的評分體系的問世，該評分系統可以將直腸結腸癌病人T細胞密度、類型、定位等信息定量地結合在一起，並進行進一步的預後評估。根據這樣的思路在對巨噬細胞整體進行某些指標的定量評估前，需要考慮到巨噬細胞群體本身就具有細胞形態、功能以及腫瘤微環境定位上的異質性。早先針對巨噬細胞的檢測方法主要應用的是形態學上的評估，現在更多依靠對巨噬細胞特異性標誌物的免疫組化分析。最新的分析方法是通過基因表達譜分析或單細胞測序解析巨噬細胞相關基因的表達特徵。本研究對目前已有的這些方法進行了評估，討論其優點和局限性。
3.1病理學評估
上述方法，是通過譜系標記CD68來對巨噬細胞進行標記。但是前文已經述及巨噬細胞在其分化成熟過程中存在可塑性，即巨噬細胞可能會在不同的微環境刺激下，發生其功能的重編程。因此有理由認為巨噬細胞的功能激活標記也許比譜系標記更適合作為生化標誌物進行應用。根據巨噬細胞的功能激活狀態，目前廣泛接受的分類方法是M1/M2二分法，即分為激活表型(M1)和選擇性激活的免疫抑制表型(M2)。但是很顯然體內環境中的巨噬細胞考慮到微環境中多種細胞因子或刺激對它的影響，其功能表型難以明確定義，通常處在這兩種分類M1/M2的混合組成狀態。或者當巨噬細胞處於免疫應答過程或某種病理環境之下，也有可能使得巨噬細胞的功能激活狀態產生變化。儘管巨噬細胞的功能狀態可能發生如上所述的多種變化，但是功能激活標記分類已經應用於對巨噬細胞進行評估，並常常聯合巨噬細胞的密度一起作為病人的預後指標。
沿著這條思路，CD163和血紅蛋白珠蛋白複合物的高親和力清道夫受體，以及其他清道夫受體如CD206（甘露糖受體）與巨噬細胞M2表型即免疫調節表型密切相關，即這些受體可以提示巨噬細胞的分化傾向性。在另一方面，在非小細胞肺癌病人中發現體內巨噬細胞的HLA-DR+受體常常提示巨噬細胞向M1方向分化，這通常提示了較好的預後。這些受體如下圖所示：
補充：巨噬細胞的不同分化：巨噬細胞作為一種具有可塑性和多能性的細胞群體，在體內外不同的微環境影響下，表現出明顯的功能差異。根據活化狀態和發揮功能的不同，巨噬細胞主要可分為M1型即經典活化的巨噬細胞，和M2型即替代性活化的巨噬細胞。巨噬細胞是一種極具異質性的細胞群體，在體內複雜的微環境中，表現出獨特的表型和功能 。研究者認為巨噬細胞存在一系列連續的功能狀態，而M1型和M2型巨噬細胞是這一連續狀態兩個極端。M1型巨噬細胞通過分泌促炎性細胞因子和趨化因子，並專職提呈抗原，參與正向免疫應答，發揮免疫監視的功能；M2型巨噬細胞僅有較弱抗原提呈能力，並通過分泌抑制性細胞因子IL-10或TGF-B等下調免疫應答，在免疫調節中發揮重要作用。通過表型鑑定巨噬細胞的類型，在研究巨噬細胞在不同生理和病理條件下所發揮的功能具有重要的意義。然而，仍沒有公認的表型標誌來鑑定和區分不同類型的巨噬細胞，M1型和M2型巨噬細胞的表型特徵尚無定論。
除了上述功能標記以外，巨噬細胞的形態特徵也在作為預後指標方面受到了關注。有關形態特徵的研究可以追溯到早期在體外環境下或是在體內纖維變性或是慢性炎症組織中對巨噬細胞形態特徵的觀察。這表明，巨噬細胞的形態與其功能狀態也存在關聯，進而可以對其在腫瘤組織中發揮的功能進行預測。並且在最近一項關於結腸直腸癌肝轉移的研究中，研究者發現了不同的小巨噬細胞和大巨噬細胞具有非常不同的轉錄譜（提示形態與功能以及基因表達相關）。具體實例如下圖所示：
巨噬細胞可以作為預後指標的重要原因在於其與臨床轉歸具有相關性，但是應用它的複雜性在於巨噬細胞的異質性。小鼠組織巨噬細胞的轉錄譜顯示，不同器官的巨噬細胞具有非常高的轉錄多樣性，這表明巨噬細胞極有可能存在不同的器官特異性細胞群。例如，在肝臟中表達一組相同表面分子(如人體內的CD68和HLA-DR或小鼠體內的F4/80)的巨噬細胞共存。它們可能來自循環系統或組織中，並執行不同的組織特異性任務如鐵代謝和膽固醇處理。這些群體在生理功能上各異，其在病理反應中發揮的功能也存在區別。這表明將巨噬細胞群體作為一個整體來進行分析似乎並不利於預後的預測評估。總的來說，目前同一組織內存在不同巨噬細胞群體以及達成了共識，但是尚未出現明確的標誌物來對這種異質性進行準確的定義與分類。
3.2單細胞技術的應用-質譜流式細胞技術
在腫瘤微環境中引入最新的單細胞技術，使得研究者可以從全新的角度去解析巨噬細胞的多種指標，並為上述傳統方法難以解決的問題提供了新思路。目前已經投入應用的技術包括單細胞RNA測序，質譜流式細胞技術（允許同時檢測超過50個分子，包括膜標誌物，細胞因子和轉錄因子等等）。
基於單細胞的技術已經成功應用於腦部腫瘤組織免疫系統特徵的解析。與膠質瘤相比，腦部轉移瘤明顯具有更多的髓系細胞成分（包括巨噬細胞），這表明巨噬細胞對於腫瘤組織的作用受到腫瘤部位以及類型的影響。質譜流式細胞術的結果證明，膠質瘤組織中的巨噬細胞主要為原組織內或是反應性小膠質細胞衍生而來，而腦部轉移瘤的巨噬細胞多由其他組織或血液循環中轉移而來。有趣的是，在膠質瘤患者中，只有血液來源的巨噬細胞的數量與臨床結果相關。這表明在觀察臨床結果時，考慮巨噬細胞的表型和起源可能比單純的數量更重要。與這項觀察相一致的是，肺腺癌患者早期巨噬細胞的數量分布在腫瘤組織和正常組織無顯著差別，但是其基因表達譜發生了變化，腫瘤組織中的巨噬細胞呈現過氧化物酶體增殖物激活受體PPAR-γ和IL-6相關基因的高表達。
3.3 單細胞技術應用-單細胞RNA測序
質譜流式細胞術也如同其他抗體技術，缺點在於其標誌物需要根據先前已得到的結論進行選擇（可能帶來一定的偏倚）。單細胞RNA測序技術則可以在無偏倚條件下進行，並同時可以測量上千個基因。因此即便是在疾病早期，單細胞RNA測序技術也可以很好的深入分析巨噬細胞的異質性，並判別治療靶點。單細胞RNA測序這樣的技術應用的同時會產生大量數據，這些數據需要由生物信息學的專家進行計算分析。在對數據進行探究並進行可視化的同時，可以把這些數據以低維度的形式進行展示。數據降維方法如：t分布隨機鄰域嵌入（t-SNE），一致流形逼近與投影(UMAP)。應用這些方法處理數據後，可以得到一些有意義的細胞簇。如下圖就是一個t-SNE應用的例子：
單細胞轉錄組學在描述膠質母細胞瘤、肺癌、乳腺癌、肝細胞癌和結直腸癌等腫瘤的巨噬細胞基因起源和表型方面取得了巨大進展。早期到轉移階段的肺腺癌組織中的免疫細胞動力學已經得到了廣泛研究，發現組織中原有的髓系細胞成分逐漸被血液來源的巨噬細胞和樹突狀細胞所取代。在最近的一項關於肝細胞癌的研究中，研究者採用結合兩種不同的scRNAseq技術的方法，在大量細胞中對巨噬細胞亞群進行了分類。在確定的6個巨噬細胞亞群中，發現兩個具有不同表型的簇類似於髓源性免疫抑制細胞(MDSC)或TAMs在腫瘤組織中富集。在腫瘤基因組圖譜(TCGA)，肝細胞肝癌只有TAM樣基因與較差的預後相關。scRNAseq也被用於了解骨髓靶向治療如抗CSF1R和抗cd40治療的反應。在CRC小鼠模型中，抗csf1r在面對不同巨噬細胞亞群方面其療效具有差異。特別是一組TAMs亞群具有促血管生成和免疫抑制表型，對治療具有耐藥性，這就提出了如何更有效地靶向巨噬細胞的問題。
4 結論
腫瘤微環境的巨噬細胞與術後腫瘤進展以及治療反映密切相關。這為開發以巨噬細胞為基礎的預後評估工具帶來了希望。基於多種指標的預後評估體系的形成正在緩慢提高研究者將患者進行臨床分層的能力，使得患者的臨床管理得到改進。目前為止有關巨噬細胞的研究主要集中在譜系標記中，但是新出現的單細胞技術也正在挖掘腫瘤組織中巨噬細胞的異質性和複雜性。一旦將這些指標轉化為可定量的參數，就可以整合到預後評分中對原本基於T細胞的分析做出進一步補充。
編輯：曾令舸
校審：呂瓊
END
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