美國藥典對現有殘餘DNA檢測技術的評價

正如前面講過，2015年版的美國藥典將新增章節對殘餘DNA檢測進行規範化，那究竟和現有方法有什麼不同？為什麼最後只確定了一種方法？我們來看看現行美國藥典對於殘餘DNA檢測的總體要求[General Chapter〈1130〉 NUCLEIC ACID-BASED TECHNIQUES—APPROACHES FOR DETECTING TRACE NUCLEIC ACIDS (RESIDUAL DNA TESTING)]。「因為殘留DNA涉及到潛在來源（傳染性病毒DNA）、管理規程等關鍵問題，藥品監管部門建議必須建立產品的DNA殘留檢測方法。不論是否成品的常規檢測包含DNA殘留含量檢測，還是工藝開發中已經證實了DNA清除率，殘留DNA技術指標和定量分析監測規程都必須確立。分析方法包括雜交法、基於DNA結合蛋白的免疫色譜法（閥值法）、定量PCR（Q-PCR）或其他DNA擴增方法。理想的定量檢測方法的靈敏度應該能夠檢測到約10pg/劑量的殘留DNA。雜交法、閥值法和定量PCR方法因為靈敏度可以達到檢測要求，所以屬於經典方法。」下面我們引用美國藥典（USP）<1130>的內容分別介紹一下這三種方法。

雜交法（Hybridization-based）：在這種方法中，根據宿主DNA序列設計DNA探針用於測定產品中配對DNA的數量。雙鏈DNA被變性成單鏈後固定在尼龍膜或硝化纖維膜上，DNA探針被放射或螢光隨機摻入標記以後，與膜上固定的樣品宿主DNA雜交結合，並在膠片或成像儀對應位置中顯現斑點。對於螢光標記的探針，斑點的光密度結果可以在儀器中定量分析。斑點光密度對應結合在目標DNA上的探針數，進而推測出殘留DNA的數量。通過目測方法可以半定量地檢測樣品中殘留DNA，儀器讀片可以對應斑點光密度繪製標準曲線，對應檢測結果更加準確。

DNA結合蛋白免疫閾值法（DNA-BINDING PROTEIN-BASED）：這種方法使用DNA結合蛋白和DNA抗體，分四步檢測。第一步，通過加熱把DNA變性成單鏈DNA，變性後DNA與偶聯了親和素的DNA結合蛋白以及偶聯了尿素酶的DNA單克隆抗體混合反應，液相中的單鏈DNA、DNA結合蛋白、DNA抗體共同形成序列非特異的複合物。第二步，樣品混合液通過生物素標記的膜，親和素-生物素結合把DNA複合物固定在膜上，洗去非特異吸附。第三步，膜放入檢測儀器中與尿素溶液反應，反應產物氨改變溶液pH值並被儀器記錄變化。這種pH值的變化直接與樣品中的DNA數目相關。第四步，儀器軟體自動分析原始數據確定樣品中殘留DNA數量。

定量PCR法（QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR方法以其快速、高通量的特點已經被應用於生物製藥的一些領域（拷貝數檢測與病毒檢測）。這項技術能夠確定各種樣品中目標DNA序列的準確數量。DNA探針的設計非常關鍵，這種DNA探針包含一端染料分子和另一端淬滅分子。當特殊設計的DNA引物引導DNA聚合酶沿著模板序列複製合成另一條對應序列時，DNA聚合酶切斷結合在目標DNA上的探針染料端，釋放到反應液裡的染料信號被儀器測量。經過數十個循環的DNA擴增，螢光信號與起始DNA模板成對應關係，對應標準曲線可以準確計算出樣品中殘留DNA的數量。

美國藥典附錄進一步對三種方法進行了應用評價。雜交法可以序列特異性地檢測目標DNA，但32P標記的探針因為存在半衰期短、放射等問題，實際應用並不廣泛。螢光標記的探針如果採用儀器讀取信號，雜交法理論上可以達到定量檢測要求的靈敏度，但是檢測時間需要48小時。閾值法因為是採用DNA抗體的非特異序列免疫檢測技術，不能特異性識別宿主殘留DNA序列，且容易受到環境和操作人員的DNA汙染，導致讀值偏高。qPCR法具有序列特異性，靈敏度、準確度、精密度都好，還可以高通量篩選，但開發一個合格的q-PCR試劑檢測宿主殘留DNA並不是件容易的事情。有人會提出疑問，終產品中應該限定任何物種的DNA殘餘以確保安全性，所以閾值法是不是最合理的分析方法？這裡還需要強調一下宿主殘餘DNA檢測的目的：1.確認純化工藝合理，能有效去除宿主DNA殘餘；2.確認產品中雜質含量符合標準要求。非特異性的DNA檢測結果不能區分究竟是生產中汙染、檢測汙染、或是工藝缺陷引起的DNA殘餘，就無法為解決方案提供有效信息。在嚴格的生產體系中，殘留DNA檢測是解決工藝合理性問題，任何外源汙染問題都歸SOP或GMP管理體系解決。最後，經典的殘留DNA檢測方法靈敏度不同，qPCR法、DNA結合法、雜交法的檢測限分別達到<1、3、6pg/樣品的水平（目前qPCR法靈敏度可達10fg），但是技術上限制，要求待測DNA片段分別不能小於50、150、600bp才能用於雜交法、q-PCR法、閾值法檢測，而WHO和FDA可接受的DNA 限度內的片段長度<200bp。由此可見，這三種方法中，qPCR法的適用性和技術指標最好。從qPCR技術原理來看，Taqman法要優於螢光染料隨機摻入的SYBR Green法。正如前面介紹的USP修訂內容，經過幾年來對三種檢測方法的系統研究和應用反饋，美國藥典會將在新版藥典中唯一推薦qPCR法作為生物製品殘留DNA檢測的標準方法。