科研顯微圖像的共定位分析講座Q & A(Part 1)

2021-01-14 清華細胞生物學平臺

2020年6月4日，細胞生物學平臺邀請Olympus的資深應用工程師高瑩瑩進行了題為「科研顯微圖像的共定位分析」的講座，主要介紹了共定位相關的數字圖像概念，圖像共定位分析的方法及常用參數，圖像採集對共定位結果的影響，以及共定位分析的其他研究方法。整個講座氣氛熱烈，同學和老師們於線上積極互動，一起討論和交流，現整理出精彩問答，供大家學習和交流。

Q：共定位有沒有一個protocol，如樣本處理和圖片採集的過程。

A：不同的軟體操作步驟可能有差異，但基本步驟的邏輯為：1）選定共定位分析的兩個通道，2）設定閾值，篩選有效信號，3）選定信號的灰度值代入後臺的計算公式，4）獲得分析結果，包括但不限：相關係數，重疊係數，共定位分析統計表，共定位圖層。

     樣品處理範疇寬廣，可以關注樣品製備專題。

     共定位分析圖像採集，包括但不限以下幾點建議：1）設置對照組，陽性或陰性，2）採集高信噪比圖像，3）絕對不可過曝，4）儘可能選擇高辨率成像，5）防止串色，6）使用高標準的復消色差物鏡或專為共定位圖像分析設計的物鏡，例如OLYMPUS完美共定位物鏡PLAPON60XOSC2。7)符合Nyquist採樣率

Q：能分享一下共定位前的樣品製備的protocol嗎？

A：一般樣品製備流程，可以關注樣品製備專題。建議根據自己的樣品性質，查閱文獻，個性化地準備實驗樣品。共定位分析成像，建議在選擇染料/標記蛋白是使用激發-發射光譜分得開的兩種。

Q：為什麼會發生串色？

A：螢光觀察時候常使用螢光染料或螢光蛋白標記，其自身有其光譜特性，每一種染料/蛋白都有特定的激發和發射光譜。當兩種染料/蛋白的激發（Abs）-發射（Em）光譜有重疊時，就有可能在採集時產生串色。

    因此，共定位圖像建議使用光譜距離較遠的染料/蛋白，使用濾色片/光柵精確選擇採集的波段，避開重疊的光譜範圍。目前共聚焦顯微鏡的光柵分光可以達到幾個nm的精度，例如FV3000共聚焦的VPH透射型全息體相位光柵，精度可達2nm。

Q：圖像採集時，如何判斷自己的offset設置在合理範圍，根據自己的圖像質量嘛？

A：共聚焦顯微鏡的offset值推薦參考廠家默認值，不同的系統該矯正數值不同。一個粗略的估測建議，正常的採集參數，採集一張無樣本信號的圖像（背景），測量該圖的平均灰度值，從0逐漸增加offset值到該圖信號幾乎為0但不全為0的狀態。

 

Q：第一個共定位可以看灰度的，是什麼軟體？

A：共定位分析的計算使用像素點的灰度值，共定位的分析結果為相關係數/重疊係數，數值範圍在-1~1之間。許多專業的顯微圖像軟體都有共定位分析模塊，除了廠家分析軟體如cellSens，免費開源軟體FIJI/ImageJ也有共定位分析插件。

 

Q：有ImageJ共定位圖像處理的protocol嗎？

A：FIJI中的共定位插件可以嘗試用coloc2。FIJI中的插件在其help網頁大都有詳細的參數講解和步驟說明，示例，可以參考網頁信息，完成插件的使用。https://imagejQ：net/Help

 

Q：怎麼用cellsens軟體獲取共定位參數Rr,R,K1Kr？

A：步驟如圖，選擇通道，設定閾值，共定位分析結果位於step4標記區域。該界面單擊「確定「後會生成統計圖表和新的共定位圖層。


清華大學生物醫學測試中心細胞生物平臺以科研服務為宗旨，是清華大學-北京大學生命科學聯合中心的支撐機構。為清華大學生命、醫學以及化學、化工、環境、材料、航天等相關學科的科學研究與人才培養工作提供技術支撐與測試服務。主要提供細胞生物學影像及分析測試服務。目前平臺設有光鏡機組和電鏡機組。

光鏡機組儀器

·      受激發射損耗超高解析度共聚焦顯微鏡

Leica TCS SP8 gSTED 3X（17002186）

·      倒置雷射共聚焦顯微鏡Zeiss

LSM710 3-channel（12027558）

·      倒置雷射共聚焦顯微鏡

Zeiss  LSM710 META（09018326）

·      全自動數字玻片掃描系統

Zeiss Axio Scan. Z1（17026728）

·      全自動數字玻片掃描系統

3DHISTECH Pannoramic Scan（A18000062）

·      全自動活細胞顯微成像系統

Nikon Ti2-E（A18000063）

·       活細胞工作站

Olympus IX81（10005154）

·       全內反射顯微鏡

Olympus IX83（17005698）

·       螢光光鑷系統

Lumicks C-Trap G2（A19000044）

·      高配置的數據處理工作站和專業的分析軟體


電鏡機組儀器

·      透射電子顯微鏡日立

H-7650B（08019685）

·      透射電子顯微鏡

FEI Tecnai Spirit（16041491）

·      掃描電子顯微鏡

FEIQuanta 200（08019747）

·      超薄切片機

LeicaEM UC6 （08018130）

·      冷凍超薄切片機

LeicaEM UC7 （15005387）

·      高端數據處理軟體，滿足用戶電鏡數據分析需求提供制樣、切片服務


聯繫方式

光鏡機組：010-62789417-223/191；清華大學醫學科學樓C119/C132

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