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老司機帶你解鎖螢光共定位分析
雷射掃描共聚焦顯微鏡在生命醫學研究中廣泛應用,通過共聚焦顯微鏡獲取的圖片可進行共定位分析。生物學上螢光共定位(Colocalization)指兩個或多個不同分子位於細胞中的同一結構,常用來研究兩個螢光分子在組織或者細胞中的位置關係以及可能存在的相互作用。
共定位圖像包含了豐富的信息,但對圖像數據的視覺解釋只能定性,難以描述其統計學意義,且存在遺漏潛在信息的可能。因此需要使用軟體對共定位圖像進行系統的分析。今天半夏就給大家分享使用ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/)進行系統螢光共定位分析的實用技能!
在螢光共定位分析前先給大家分享共定位分析的前期準備工作:
1. 圖像獲取
圖像應以順序掃描方式獲取以消除螢光的交叉幹擾和確保共定位的可靠定量,並以Tiff格式進行保存防止信息丟失。
2. 背景校正
考慮多種因素,包括免疫螢光的強度和共聚焦用於獲取圖像的模式;為了獲得定量結果具有可比性,同一研究中的所有圖片應該保持一致。有報導稱背景校正的圖像可能會導致高達30%的共定位過高估計。
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ScatterJ插件下載與安裝
ScatterJ是一款基於Java的免費、專業多圖像處理ImageJ插件,該插件可用於各種不同的二維(2D)和三維(3D)圖片分析。對於共聚焦圖像分析而言,ScatterJ集成了許多強大和實用的輔助功能,可以簡單快捷地實現共聚焦散點圖繪製、相關性分析等。
下載解壓後,將ScatterJ_.class文件移動到ImageJ安裝目錄的Plugins文件夾中,重啟ImageJ即可在Plugins下拉菜單中找到ScatterJ。下圖為ScatterJ的基本操作界面:
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螢光共定位分析
1. 文獻中出現最多的共定位分析方法
下圖是SCI文獻中出現最多也是最基本的螢光共定位分析方法:
我們可以使用ImageJ的Plot Profile工具實現上述分析。
步驟:
(1)File -> Open打開需要分析的螢光圖片
(2)對於RGB圖片,可通過Image -> Color -> Split channels將各通道分開。如果在拍攝時涉及紅綠藍以外的通道,推薦將各通道分開保存。因為無論圖像原本有多少通道,ImageJ也只能拆分出紅綠藍三通道。
(3)Image -> Stacks -> Images to stack,將多幅圖像變成圖像棧。
(4)選擇工具欄中的直線工具(Line)或矩形工具(Rectangluar),選定圖像棧中感興趣的區域,Analyze>Plot profile,彈出的圖像中,橫軸代表線上各像素點,縱軸為各點對應的灰度值;因此圖像代表了灰度的變化趨勢。點擊live使結果圖與圖像棧中的圖像相對應。對比各通道結果圖可以大致了解共定位情況,根據需要可以將數據導出Excel重新繪圖。
(5)通過Plot Profile分析的一個好處是可以直觀地看到圖像拍攝的曝光情況。當圖像過曝時,灰度值的峰會超過最大值灰度值255,導致圖像頂端變成平的。過曝會導致原本可能存在差異的灰度信息丟失。如果離最大灰度值較遠說明曝光過淺,過淺也可能導致信息的丟失。
Plot Profile進行共定位分析的缺點是不能對共定位進行定量描述,因此需要進行進一步的定量分析。
2. 螢光共定位定量分析方法
(1)Colocalization Finder插件分析共定位
步驟:
(1.1)打開待分析圖片:
(1.2)Image -> Color -> Split channels拆分螢光通道:
(1.3)Plugins -> Colocalization Finder分析紅綠通道共定位情況:
得到共定位散點圖,散點圖越接對角線共定位程度越高:
散點圖顏色的深淺代表其出現的頻率,Plugins -> 3D -> Interactive 3D Surface Plot可以直觀的顯示:
而雙尾分叉形狀的散點圖共定位效果差:
除散點圖外Colocalization Finder還可以得到定量數據:
定量數據解釋如下:
這麼多定量數據我們該如何選擇?
Pearson’s相關係數(PCC),兩通道之間的強度分布關係;
Manders重疊係數(MOC),共定位的真實程度;
重疊係數k1和k2,共定位係數m1和m2,共定位係數M1和M2,每個特定抗原對於共定位區域的貢獻度。
多數情況下,PCC提供了清晰與適合的結果。
如果一種染色強度大於另一種,MOC的共定位係數更加可靠。
(2)如何計算共定位像素
螢光共定位的百分比也是常見的定量共定位分析方法:
下圖最右側白色為共定位像素:
分析步驟:
ImageJ打開螢光圖片,Plugin -> Colocalization Finder分析紅綠通道共定位情況。在Tumor_cells紅色螢光通道上顯示共定位像素,會在Image3上顯示為綠色:
綠色顯示的即為共定位像素:
Image -> Type將共定位像素圖片由RGB轉換為HSB Stack圖片,飽和度(Saturation)圖片對應共定位像素,Image ->Adjust Threshold選中共定位像素後續測量面積即可。
(3)有關3D共定位分析
方法為打開層掃螢光圖片在ImageJ主菜單上點擊Image -> Stacks -> Orthogonal views,即可顯示XY,XZ,YZ視圖,XY視圖中的黃色十字可以用滑鼠拖動。
(4)ScatterJ共定位分析
(4.1)ScatterJ繪製共定位散點圖
共定位散點圖可以直觀和定量地描述共定位程度。在ScatterJ中可以方便地實現散點圖地繪製。
步驟:
(4.1.1)圖像導入:ScatterJ要求被導入的圖像必須為相同尺寸的8位灰度格式圖片,且各圖間的像素點應是嚴格對應的。如有必要圖像導入前可進行去背景處理。對於疊加後的多通道圖像,我們可以直接通過圖像拆分(Image > Color > Split channels)得到符合導入要求的一組圖像。
(4.1.2)繪製散點圖:Plugins > ScatterJ >Create scatterplot>stack1和2中選擇需要分析的通道:
散點圖的橫軸和縱軸分別帶別每個像素點在各通道得到的灰度值,因此圖像越接近對角線,表示共定位程度越高。
(4.1.3)點擊Axes,在Define axes中可自定義坐標軸、命名坐標軸標題等。calibration factor x(y)校準係數可以將每個軸8位灰度值轉換成有意義的單位。從而使用有意義的單位而不是使用灰度值進行分析。對於免疫組化圖像,如果需要根據光密度值換算成分濃度,即可通過此功能實現。
Colour scale>Define colours可根據自己的需要改變散點圖顏色分布,使圖像更加美觀。
(4.1.4)回歸分析
ScatterJ提供了三種不同的回歸方法,包括最小二乘(ordinary least squares)、長軸回歸法(major axis,MA)和簡化長軸回歸法(reduced major axis regression)
勾選Pearson’s coefficient可在結果中顯示Pearson相關係數。Pearson可以定量表述兩個連續變量間線性關係的密切程度和相關方向。其數值介於-1到1,取值越接近0,變量間相關性越低;取值接近1或-1,則相關性越強。正負號代表相關的方向,為正相關或者負相關。
輸出的結果包括計算出的回歸線和Pearson相關係數。
除了將回歸線繪製到散點圖中外,對於MA回歸,ScatterJ還允許計算和繪製假設的雙變量正態分布的短軸(即垂直於MA的軸)和95%置信橢圓。
(4.2)Backmapping工具
Backmapping工具可根據散點圖中的點回溯到輸入圖像中對應的像素點。如果對共定位散點圖中某個區域感興趣,如散點圖中標出的分叉的部分,可通過ROI工具對其進行選擇,點擊backmapping進行回溯,即可在原始輸入圖片中顯示對應像素點。
為了方便分析,可通過Image>colour>merge channels將結果圖與單通道圖像疊加,由於螢光圖是偽彩圖,我們可以根據需要選擇通道的顏色,使得疊加後的圖像更加美觀和易於觀察。
(4.3)Deviation map工具
Deviation maps工具會計算每一個像素點在散點圖中與參考線的距離,並以不同的顏色標註出來。這裡的參考線可以是計算得到的相關性回歸線,也可以是用戶自定義的。可根據不同的需要選擇計算水平距離、垂直距離、水平和垂直距離的幾何平均數或者角度距離(數據點和參考線的位置向量包圍的角度)。
如果以計算得到的回歸線為參考線,可以先點擊Statistics完成數據分析,再進入Deviation map,系統會自動將回歸線相關數據輸入Deviation map菜單中。
在許多情況下,儘管共定位散點圖總體呈線性趨勢,但點群仍會存在一定程度的擴散。通過Deviation maps工具生成的偏差圖,我們可以分析這樣的擴散是由實際的差異造成的,還是僅僅由統計差異造成。
如圖,偏差圖中隨機分布的顏色表示純粹的統計學差異。白色為背景。
如果出現某一顏色的集中富集,說明像素群的擴散是由樣本中的成分變化造成的,如圖中紅色區域。這樣的信息在原始圖像中是很難發現的。
ScatterJ在一個插件中整合了散點圖繪製、圖像優化、Backmapping工具和Deviation map工具等許多功能,不但非常方便,還有助於挖掘原始共定位圖像中難以發現的信息,非常適合螢光共定位圖片的定量分析。
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其他共定位分析工具
1. JACoP插件