Image J進行螢光共定位分析

歡迎分享本文到朋友圈，文章轉載、投稿、業務合作聯繫請微信Havana90~~3777字+圖文，兩個晚上~其實上次計算螢光Ratio的方法，就可以用來定性描述螢光共定位。畢竟同一個位置，不同分子所帶的兩種螢光都比較強的時候，它們之間就有可能存在共定位的現象。

今天介紹一下其他二維螢光共定位分析的方法。

2、利用矩形或者直線工具，框出或者畫出需要進行共定位分析的部位；

3、選擇Analyze-Plot Profile，會出現一條曲線，這條曲線是矩形選區或者直線經過像素的灰階值曲線，曲線上面出現峰說明這個地方的像素灰階值比較大，換句話說就是這個像素有螢光發出；

4、選擇Data裡面的Save Data，存為csv文件，這是所選區域的紅色通道像素和灰階值之間的關係數據；

5、關掉選區紅通道的Plot Profile曲線，在堆棧圖上切換到綠色通道，同樣的方法獲得綠通道的Plot Profile曲線，點擊Data-Copy All Data，將數據複製粘貼到上一步獲得的紅通道數據後面；

6、重複第4步驟，獲得藍通道的曲線數據，將三次曲線數據合併到一起；利用excel或者其他軟體作圖；

從右邊的曲線可以明顯看出，圖中所選區域紅綠兩種螢光灰度值都不為0，表明有兩種螢光的共定位，但是藍色螢光基本為0，跟紅綠兩種螢光不存在共定位，事實上也是在細胞核之外。

在一些肉眼不太好判斷是否有螢光共定位的時候，這種做曲線的方法會更為直觀。

Majzoub RamseyN,Chan Chia-Ling,Ewert Kai K et al. Fluorescence microscopy colocalization oflipid-nucleic acid nanoparticles with wildtype and mutant Rab5-GFP: A platformfor investigating early endosomal events.[J] .Biochim. Biophys. Acta, 2015,1848: 1308-18.

下圖這種傾斜矩形框，最好在ps裡面把紅色選框區域做好標記，然後把這個區域摳出來，擺正再在進行測量。ImageJ也可以做這些事情，不過不太方便。

O'Brien CaitlinE,Bonanno Liana,Zhang Hui et al. Beclin 1 regulates neuronal transforminggrowth factor-β signaling by mediating recycling of the type I receptorALK5.[J] .Mol Neurodegener, 2015, 10: 69.

這種圖也有不少人在網上求教程。下圖是小木蟲上面的求助：

1、打開一張螢光圖片，並拆分成三個通道圖，具體見《利用ImageJ拆分和Merge螢光圖片》。

2、選擇Analyze-Colocalization-Colocalization Threshold；

在Colocalization菜單下面還有Colocalization和Coloc2插件，功能類似，有興趣的自己摸索下；尤其是Coloc2，因為能計算除了Pearson相關係數之外的其他多種相關係數，應用比較廣，可以參考以下文獻：MoserBernhard,Hochreiter Bernhard,Herbst Ruth et al. Fluorescence colocalizationmicroscopy analysis can be improved by combining object-recognition withpixel-intensity-correlation.[J] .Biotechnol J, 2017, 12: undefined.Honeker LinneaK,Root Robert A,Chorover Jon et al. Resolving colocalization of bacteria andmetal(loid)s on plant root surfaces by combining fluorescence in situhybridization (FISH) with multiple-energy micro-focused X-ray fluorescence (MEμXRF).[J] .J. Microbiol. Methods, 2016, 131: 23-33.3、在Channel1和Channel2上選擇需要共定位分析的兩個顏色通道，這裡選擇紅綠兩個通道（C1-3(RGB).tiff、C2-3(RGB).tiff），勾選「ShowColocalized Pixl Map」和「Show Scatter plot」，這兩個圖可以用到論文中去，「Useconstant intensity or colocalized pixel」和「Includezero-zero pixels in threshold calculation」分別是對這兩個選項的限定。「Set Options」裡面有對結果圖的設定，一般都是全選的，不需要修改。

從Scatter Plot圖和Rcoloc值來看，這張圖的紅綠通道共定位情況其實並不好。

我們換成綠色和藍色通道之間進行共定位分析試試：

Scatter Plot圖和Rcoloc值都要好很多。

類似使用ScatterPlot圖和Rcoloc值的論文有不少。如：

Zinchuk Vadim,WuYong,Grossenbacher-Zinchuk Olga,Bridging the gap between qualitative andquantitative colocalization results in fluorescence microscopy studies.[J] .SciRep, 2013, 3: 1365.

相同功能的插件還有Colocalization Finder，有興趣的自己下載下來摸索下。https://imagej.nih.gov/ij/plugins/colocalization-finder.html目前我們介紹對二維螢光共定位分析的三種方法：一種是計算螢光Ratio，是定性描述；第二種是做Plot  Profile圖，適合於肉眼不太好分辨是否有共定位區域的描述；第三種是做Scatter Plot，算相關係數，可以把螢光共定位轉化為定性+定量的描述，相對來說最準確。鑑於有些同學說Fiji很難下載，下面我把Fiji的win64版和mac版放在了網盤裡面，有需要的請自行下載。

連結：https://pan.baidu.com/s/1JCEtW0jMwnB3mV6jiXlatw

提取碼：xol8（請複製粘貼使用提取碼，我知道你們分不清1和I和l）

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