...分子共組裝與生物功能分子響應解組裝策略開展多模態活體成像分析

近日，南京大學化學化工學院生命分析化學國家重點實驗室葉德舉教授課題組構建了肝臟靶向、穀胱甘肽（GSH）響應的三模態分子影像探針，利用分子共組裝和響應性解組裝過程，產生螢光/19F MRS/1H MRI三種模態信號變化，應用於肝臟中GSH水平的無創、實時監測，進而快速評估脂多糖誘導的急性肝炎和抗炎藥物療效。相關成果以「Responsive Trimodal Probes for In Vivo Imaging of Liver Inflammation by Coassembly and GSH-Driven Disassembly」為題發表在Research上 (Research, 2020, 4087069, DOI: 10.34133/2020/4087069)。

研究背景

急性肝炎的早期診斷和治療過程監測對其治療和預後非常重要。臨床上針對急性肝炎常用的檢測方法包括血液檢測、腹部超聲或CT成像。然而對相關肝酶（如天冬氨酸氨基轉移酶、鹼性磷酸酶等）的血液檢測無法準確定位肝臟中產生炎症的位置。腹部超聲或計算機斷層掃描成像往往只能檢測到在肝炎後期已經產生顯著病理變化的異常肝組織，而且該方法缺乏特異性，無法實現急性肝炎的早期、準確診斷。

生物標誌物特異性成像探針，能夠對疾病標誌物進行準確的成像分析，已成為疾病早期檢測的重要工具。雖然人們已經開發出炎症標誌物（如活性氧和鹼性磷酸酶）特異性響應的分子影像探針用於在活體層面對急性肝炎進行成像分析，然而這些已報導的探針主要基於螢光成像，無法對較深位置的肝臟進行高解析度的成像分析。因此，急性肝炎的活體成像檢測仍有較大挑戰。結合不同成像技術，發展肝炎標誌物特異性響應的多模態成像探針，對於急性肝炎的早期準確檢測具有重要意義。

研究進展

穀胱甘肽（GSH）是肝臟中大量存在的一種生物硫醇，對於維持正常肝細胞的氧化還原平衡具有重要作用。當炎症發生時，其濃度顯著下降，因此GSH被認為是急性肝炎的重要標誌物。基於此，南京大學葉德舉教授團隊發展了一種GSH響應的螢光/19F MRS/1H MRI三模態成像探針用於急性肝炎的早期成像檢測。作者將帶有肝臟靶向基團（β-Gal）的探針（1-Gal）與帶有Gd3+造影劑的MRI成像探針（1-Gd）共組裝形成均勻的有機納米顆粒（圖1a）。尾靜脈注射進入體內後，探針通過肝臟靶向基團快速富集到肝臟細胞中。在正常肝細胞內大量存在的GSH作用下，納米探針迅速解組裝，造成螢光信號「打開」、19F MRS信號增強、1H MRI信號減弱三種成像模態信號變化；而在炎症細胞中，由於GSH水平下調，納米探針的解組裝受到抑制，因此炎症組織中可以維持較高的1H MRI成像對比度，從而實現肝炎組織的高解析度成像分析（圖1b）。

圖1  三模態成像納米探針通過檢測GSH水平實現肝臟炎症的活體成像

圖2  納米探針的共組裝比例篩選

作者首先對肝臟靶向探針與MRI成像探針的比例進行了優化（圖2）。在考察不同比例探針的粒徑與細胞攝取能力後，作者篩選出具有較小粒徑及較高細胞攝取的納米探針（靶向/MRI為1/5）進行後續研究。優化共組裝比例後的納米探針在水溶液中能夠快速與GSH反應，分子內的二硫鍵被切斷，導致納米顆粒解聚，同時引起螢光信號增強，19F信號增強與1H MRI信號減弱（圖3）。

圖3  納米探針在溶液中與GSH作用後螢光、19F MRS和1H MRI三種成像信號的變化

隨後，作者將探針用於細胞內GSH的檢測（圖4）。探針利用肝靶向基團進入肝細胞後，在肝細胞中GSH的作用下實現螢光信號的打開。而細胞與半乳糖預孵育或用NEM下調細胞內GSH水平後，細胞內的螢光都大幅度減弱，證明探針可以通過ASGPR介導的細胞攝取通路進入HepG2細胞並被細胞中的GSH激活。GSH的下調同時導致細胞19F信號減弱，而1H MRI信號增強。這些結果驗證了探針對肝細胞中GSH的成像檢測能力。

圖4  納米探針對細胞內GSH水平的三模態成像分析

在細胞層面驗證探針可以用於細胞中GSH的成像檢測後，作者將探針應用於小鼠急性肝炎的成像檢測（圖5）。通過尾靜脈注射後，探針迅速富集在肝臟中，使得肝部MRI成像對比度顯著增強。在正常肝臟中大量GSH的作用下探針解組裝並快速代謝，導致肝臟MRI信號快速下降。而無法對GSH響應的對照探針則維持較高的MRI成像對比度。當使用LPS誘導小鼠產生急性肝炎後，肝臟的MRI信號保持較高水平，初步驗證了探針對急性肝炎的檢測能力。同時肝臟切片的螢光成像和肝臟勻漿的19F圖譜也驗證了LPS誘導產生肝炎後肝臟中GSH的下調。

圖5  納米探針對LPS誘導產生小鼠急性肝炎的成像檢測

最後，作者嘗試利用探針對小鼠肝炎的藥物治療過程進行監測（圖6）。作者發現小鼠在LPS誘導產生急性肝炎後，肝部MRI成像對比度顯著增強；使用地塞米松治療不同時間後，肝臟的MRI信號逐漸減弱，說明在肝臟恢復過程中GSH濃度逐漸增高，並最終恢復至正常水平。這一結果初步證明探針能夠對肝炎的治療效果進行無創、實時評估。

圖6  納米探針對小鼠急性肝炎的治療療效進行監測

未來展望

本研究發展了一種成分可控、肝臟靶向、高生物相容性的有機小分子組裝納米探針，可以對GSH特異性響應，通過螢光、19F-MRS和1H NMR三種成像信號準確檢測肝臟中GSH水平的變化，從而實現對肝臟炎症的無創、實時、準確的成像分析。同時，多組分小分子的可調配共組裝和響應性解組裝策略為其他生物標誌物響應型探針的設計提供了參考，為疾病的精確診斷、治療提供了一種新思路。

作者簡介

葉德舉教授現任南京大學化學化工學院教授，博士生導師，從事的研究方向主要是面向疾病標誌物開展多模態分子影像探針設計、活性檢測以及細胞和動物活體成像研究，主持國家自然科學基金優青、面上等多個項目。目前已在Nat. Chem., Nat. Commun., JACS., Angew. Chem. Int. Ed., Chem. Soc. Rev.等國際著名學術期刊發表論文80餘篇，申請專利7項，授權4項。