A-2巨球蛋白在骨骼肌肉系統疾病治療中應用的研究現狀
2019-01-23 來源：中國骨與關節損傷雜誌
作者：山西醫科大學第二醫院骨科 趙瑞鵬
正常人在年齡增長的同時人體各系統器官都在發生緩慢的衰退、老化，並產生相應的臨床症狀，骨骼肌肉系統疾病尤為明顯。最常見的骨骼肌肉系統疾病有骨性關節炎、脊柱退行性改變。骨性關節炎是一種以由關節韌帶、滑膜或直接關節軟骨異常代謝和慢性退變為主要病理變化，以關節脹痛、活動功能障礙為主要臨床表現得一種慢性疾病。骨性關節炎有著極其相似的病理過程，即創傷關節腔局部出現大量的炎症因子、基質降解酶類，如基質金屬蛋白酶（MMP）家族、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素（IL）、整合素樣金屬蛋白酶（ADAMTS）等，促使大量關節軟骨細胞凋亡，導致關節軟骨進一步退變。較為嚴重的是炎症因子誘導軟骨蛋白酶產生，進而引起軟骨組織退變降解；反過來，軟骨降解代謝產物又能促進大量炎症因子產生從而引發炎症因子的瀑布效應並形成惡性循環。因此，打破惡性循環，阻止炎症因子瀑布效應成為該類疾病預防和治療的關鍵。脊柱退行性疾病的病理、病因學說一直存在很大爭議，較權威的認證是炎症反應、感覺神經敏感、機械活動過度等多種病因引起，但炎症反應的因素更為明顯。許多動物實驗已經證實在腰背疼痛的模型中多種炎症因子上調，並證實其與腰背部疼痛有緊密的聯繫，上調的炎症因子包括TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、誘生型一氧化氮合酶、前列腺素E2。同時證實炎症分子主要由存在於髓核和纖維環處的細胞所表達，部分由周邊的巨噬細胞表達。
目前，骨骼肌肉系統疾病局限於物理治療提高肌肉強度、增加關節穩定性、降低體重減輕關節應力作用、關節腔藥物注射（類固醇類藥物和透明質酸鈉）、口服非甾體類止疼抗炎藥，終末期才考慮外科手術幹預。但研究顯示以上治療方法都有明顯的副作用，如正常活動受限的患者減輕體重比較困難，非甾體類抗炎藥過多服用會導致胃腸道出血，關節腔藥物注射較多的患者晚期行全膝關節置換術後更容易出現災難性的感染。近期研究表明，A-2巨球蛋白（A2M）在骨骼肌肉系統疾病治療中有其特殊的作用。A2M主要由肝臟上皮實質細胞合成並分泌到體液中的四聚體大分子糖蛋白，分子量為725000，在正常人血漿中的濃度為2.2~2.3mg/ml，在組織中半衰期是1~2d。電鏡下，人A2M分子的立體結構呈對稱的唇形，並通過分子結構中的長臂移動來捕獲組織蛋白酶，主要通過空間上阻止蛋白水解酶與作用底物的接觸來發揮作用。不同來源的A2M在骨骼肌肉系統疾病治療中的應用有以下幾個方面。
生物純化型A2M在骨性關節炎治療中的應用
研究顯示，關節軟骨創傷後1周內關節腔局部出現大量炎症因子、基質降解酶類，觸發正常關節軟骨細胞凋亡，導致關節軟骨進一步退行性改變。因此，早期幹預是防治骨性關節炎的關鍵。Wang等的動物實驗發現，生物純化型A2M（Roche公司）針對早期骨性關節炎具有獨特的軟骨保護作用。在離體實驗中，Wang等通過培養人骨性關節炎關節軟骨細胞並留取上清液，研究結果發現，實驗組（添加高、低不同濃度生物純化型A2M）中IL-1β、IL-8、TNF-a、GM-CSF、MMP-1、MMP-3、MMP-13水平明顯下降，同時又在體外培養的軟骨塊和軟骨C28/12細胞系中進行類似實驗，並且結果一致。在體實驗中，通過小鼠前交叉韌帶切斷術建立骨性關節炎模型，關節腔內注射不同濃度生物合成的A2M，最後獲取小鼠關節液、血清、膝關節並進行相關實驗評價治療效果，結果發現，無論從大體標本的印度墨水染色，還是組織切片的免疫組化、基因、蛋白水平檢測都顯示A2M治療組的各項指標優於對照組，而且呈劑量依賴性。
同時，Luan等的動物實驗發現，A2M是ADAMTS-7和ADAMTS-12的作用底物，可以競爭性抑制軟骨寡聚蛋白的降解。Tortorella等的研究結果證明A2M能被ADAMTS-4和ADAMTS-5降解並且抑制由其引起的軟骨基質中蛋白多糖的降解，同時還證明A2M不僅是重要的內源性MMP清除劑，也能影響MMP的基因轉錄。林子洪等也通過動物實驗證實，A2M可以減緩動物模型關節炎病變的進展速度，並提出A2M可能適合骨性關節炎發病初期的保護性治療。Wan等也證實A2M與MMP、ADAMTS形成複合物進一步被身體清除，從而保護關節軟骨並延緩其降解。
人工合成型A2M在骨性關節炎治療中的應用
螢光分子斷層掃描系統是一種較新、較敏感的生物成像方法，可通過螢光探針無創診斷活體深層組織的病變程度，而且允許連續觀察了解疾病的進展。Zhang等應用螢光分子斷層掃描發現關節創傷後的1周內，尤其第2天膝關節腔局部出現大量炎症因子、基質降解酶類並達到頂峰水平，並且觸發關節軟骨的退變和損傷。因此，創傷後1周內甚至是第2天成為防治骨性關節炎的「黃金時間」。隨著深入研究，Cytonics公司的科學家已經人工合成100多種A2M變異體（CYT-A2M），並且測試其抵抗關節軟骨降解的能力。其中，A2M變異體98（CYT-98A2M）和A2M變異體108（CYT-108A2M）能夠對更多種類的蛋白分解酶表現出更為出色的抑制能力。同時，Zhang等通過軟骨塊離體培養實驗和小鼠在體實驗進一步證實CYT-98A2M和CYT-108A2M在早期骨性關節炎發生時具有獨特的軟骨保護作用。
在離體實驗中，乳牛膝關節軟骨組織塊置於培養液平衡3d，然後添加細胞因子TNF-α（80ng/ml）和IL-1β（8ng/ml）誘發關節軟骨降解，最後獲取各組上清液檢測軟骨分解代謝指標硫酸粘多糖（sGAG）的含量；結果顯示CYT-98A2M、CYT-108A2M幹預組的sGAG含量明顯低於野生型A2M（wt-A2M）幹預組，且CYT-108A2M組的sGAG含量最低，而陽性對照組（未添加任何A2M）的sGAG含量最高；研究結果說明，CYTA2M在抑制軟骨分解代謝方面作用強於wt-A2M，而且CYT-108A2M更為明顯。在體實驗中，Zhang等通過小鼠前交叉韌帶切斷術建立骨性關節炎模型，實驗組注射不同劑量的wt-A2M、CYT-98A2M、CYT-108A2M，螢光分子斷層掃描結果顯示實驗側關節腔MMP和組織蛋白酶的含量在術後48h達到頂峰，但是wt-A2M、CYT-98A2M、CYT-108A2M幹預後MMP和組織蛋白含量明顯下降，與體外實驗結果一致；實驗組骨性關節炎研究學會國際評分（OARSI）、番紅O染色、滑膜增生染色、免疫組化、反轉錄聚合酶鏈反應等檢測結果明顯好於對照組，而CYT-108A2M高劑量組效果最好；尤其是免疫組化的檢測結果證實A2M不僅通過抑制基質降解酶類阻止軟骨的損害，還通過促進蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的合成起到軟骨保護作用。因此，wt-A2M、CYT-98A2M、CYT-108A2M能保護關節軟骨，延緩關節損傷後軟骨的退變，減慢骨性關節炎的進展，其中CYT-108A2M的保護作用更為明顯。
自體血漿濃縮型A2M在骨骼肌肉疾病治療中的應用
富血小板血漿在全身骨骼肌肉系統疾病治療中得到廣泛應用，受其啟發，Cytonics公司報導其已經掌握自體高濃度A2M血漿的製備技術，目前已經通過食品藥物管理局的批准，已經用於多種骨骼肌肉疾病的治療。該系統採用一種獨特的過濾方式，切向流經過濾器，濃縮過程較為簡單，主要涉及靜脈穿刺、血液回抽、離心超濾濃縮等過程，耗時約40min。研究結果顯示，介於輕度與中度之間的肩關節、髖關節、膝關節炎患者通過關節內注射自體高濃度A2M血漿2~4ml能明顯緩解症狀6個月或更持久。此外，自體高濃度A2M血漿已經應用於肩峰下滑囊炎、肱骨外上髁炎、跟腱炎來緩解病理疼痛。無細胞成分（不含血小板和白細胞）高濃度A2M血漿治療介於輕度與中度之間膝關節骨性關節炎的第一期臨床隨機對照試驗正在進行。
綜上所述，以上3種來源的A2M均在骨骼肌肉系統疾病治療中起重要作用，尤其是在骨性關節炎中的研究應用更為深入，其通過抑制多種炎性因子從而減緩骨骼肌肉系統的慢性退行性改變。但是，以上研究均是離體實驗或是動物實驗，大多數是通過人為造模幹預，與自然外傷因素引起的病變還是存在一定的區別。如果要轉入臨床試驗或臨床應用，以下幾方面有待突破：①骨性關節炎模型中關節液及關節軟骨中A2M含量要升高，但其水平還遠遠低於血清中濃度，導致損傷的軟骨或韌帶不能得到很好的修復或癒合，初步考慮原因是由於A2M的分子量巨大導致其不能通過關節囊屏障，但具體機制有待進一步研究；②目前特定分子量蛋白質選擇性較差，雜質較多，純度不高，自體高濃度A2M血漿濃縮技術局限於物理方法，主要取決於分子量大小，其純化技術需進一步優化。
來源：中國骨與關節損傷雜誌2018年12月第33卷第12期
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