單個預後模型太單薄？lncRNA+mRNA，真香

預後分析總能玩出新花樣，不久之前生信人公眾號推過診斷模型+預後模型的文章，預後風險評分中包含預後相關lncRNA和mRNA的也不少，今天這篇文章通過與疾病相關基因突變分組篩選差異的lncRNA和mRNA，構建共表達網絡，然後分別構建了mRNA風險評分+lncRNA風險評分，踐行了好事成雙的大道理。希望讀後你能有所啟發

High Expression of the SH3TC2-DT/SH3TC2 Gene Pair Associated With FLT3 Mutation and Poor Survival in Acute Myeloid Leukemia: An Integrated TCGA Analysis

急性髓系白血病中SH3TC2-DT/SH3TC2基因對的高表達與FLT3突變和低生存率相關：一項完整的TCGA分析

Fms樣酪氨酸激酶3（FLT3）突變是急性髓細胞性白血病（AML）中最常見的突變之一。但是，FLT3突變對生存的影響目前還沒有被充分研究，並且其致白血病的機制仍在進一步研究中。那麼該研究的目的就是識別FLT3突變AML中的差異表達基因（DEG），並找到其表達水平與預後相關的關鍵DEG，隨後進行了一系列的分析。讓我們一起來看一看作者都做了哪些研究吧~

一.材料和方法

1.1數據收集與預處理

該研究的工作流程圖如圖1所示。從TCGA中下載了151種人類AML樣本的數據，包括從IlluminaHiSeq_RNASeq平臺獲得的RNA測序數據和臨床隨訪數據，包括年齡，生存時間等。

圖1.流程圖

1.2 識別差異表達的lncRNA和mRNA

TCGA-LAML數據集由43個FLT3突變AML和108個FLT3野生型AML樣本組成。使用R包「 edgeR」來篩選FLT3突變體和FLT3野生型樣本之間的差異表達基因（DEG）。使用FDR來矯正多重假設檢驗的q值。FC≥2以及矯正後的P<0.05具有統計學意義。根據人類基因組GRCh38.93將 基因 ID轉換為基因symbol。使用R包「gplots」對DElncRNA和DEmRNA繪製了火山圖。

1.3 功能富集分析

使用R包「 clusterProfiler」進行KEGG分析。使用GSEA來鑑定SH3TC2-DT或SH3TC2高表達表型顯著富集的基因集。

1.4加權基因共表達網絡分析

使用R包WGCNA來構建DEG的共表達模塊。應用平均連鎖法和pearson相關性對TCGA-LAML的樣本進行聚類。基因i和j之間的加權鄰接矩陣定義為aij = | Cij | β（aij：基因i和基因j之間的鄰接關係，Cij：pearson相關性，β：閾值= 4）。將鄰接矩陣轉換成拓撲重疊矩陣（TOM）。最後，利用DynamicTreeCut算法構建平均連鎖層次聚類樹狀圖，將表達相似的基因分為相同的模塊。為了確定每個模塊的臨床意義，計算了基因意義（GS）來量化單個基因與臨床特徵的關聯。模塊重要性（MS）定義為模塊特徵基因（MEs）與基因表達譜之間的關聯。然後將不同的MEs與臨床特徵相關聯。

1.5 COX比例風險回歸分析

通過單變量Cox比例風險回歸評估每個黃色模塊基因的預後意義。然後，應用多變量Cox回歸分析從與預後相關的lncRNA構建一個3-lncRNA預後風險模型。對於mRNA來說，首先進行了最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸分析來選擇mRNA。然後，應用多元Cox回歸分析從選定的mRNA構建3-mRNA預後風險模型。根據風險評分中位數，將AML樣本分為高風險和低風險組。通過Kaplan–Meier分析來鑑定風險模型的預後價值。通過R包「 survivalROC」繪製ROC曲線來評估風險模型的預測準確性。通過多變量Cox回歸分析的結果繪製了列線圖以預測總體生存期（OS）。

1.6 SH3TC2-DT / SH3TC2基因對分析

對於單基因來說，應用t檢驗進行差異表達分析，應用Logistic回歸來分析SH3TC2-DT / SH3TC2表達與臨床特徵之間的關聯。為了預測SH3TC2的靶標，通過R包「edgeR」分析了SH3TC2高表達組（n = 76）和SH3TC2低表達組（n = 75）之間的DEG。然後，通過DAVID的「 Protein_Interactions」功能下的「 UCSC_TFBS」模塊對DEGs列表進行注釋。識別了DEG中顯著富集的轉錄因子（TFs）並應用Cytoscape進行了可視化。

從Vizome和TCGA下載BeatAML數據集的RNA測序數據和臨床隨訪數據，來驗證FLT3-ITD和FLT3-野生型AML之間SH3TC2-DT / SH3TC2的差異表達。同樣地計算DEG。應用GSE37642-GPL570 AML數據集來驗證SH3TC2表達水平與OS之間的關聯。根據SH3TC2的中位表達值，將136個AML樣本分為兩組。應用Kaplan–Meier曲線比較SH3TC2表達高低兩組樣本之間的OS。以上的這些統計檢驗和繪圖都是通過R和GraphPad Prism 7.0進行。

二.結果展示

2.1 FLT3-突變型和FLT3-野生型AML之間的DEmRNA和DElncRNAs

作者應用R包「 edgeR」對FLT3野生型AML和FLT3突變AML之間進行差異表達分析，共識別到差異表達的619個lncRNA（113個上調和506個下調）和1,428個mRNA（194個上調和1,234個下調）（圖2A，B） 。KEGG分析顯示DEmRNAs富集到與腫瘤發生密切相關的通路，如Wnt信號通路，PI3K-Akt信號通路和Ras信號通路（圖2C），表明FLT3突變在AML發病機制中的可能作用。

圖2. 在FLT3突變體和FLT3野生型AML之間識別DElncRNA和DEmRNA

2.2 加權共表達網絡的構建及與生存相關的模塊的識別

應用R包「 WGCNA」來構建DEG的共表達模塊，並進一步確定與預後相關的模塊。通過平均連鎖和Pearson相關性的方法對TCGA-LAML樣本進行聚類（圖3A）。軟閾值參數設置為β= 4（圖3B）。

圖3. 層次聚類樹和軟閾值估計

合併具有高度相似性的模塊後，通過平均連鎖層次聚類（圖4A）生成了總共27個模塊，模塊的基因數目大小從31到327個不等。其中非共表達的基因被分組為「灰色」模塊，並排除在進一步的分析中。隨機選擇的400個DEGs的熱圖顯示每個模塊中共表達基因的高度拓撲重疊（圖4B）。特徵基因鄰接熱圖顯示了27個共表達模塊之間的關係（圖4C）。最後，確定了這些模塊與臨床特徵之間的相關性（圖4D）。

圖4. 共表達基因和模塊與性狀關係的網絡構建

其中黃色模塊與骨髓高白細胞（WBC）計數和胚細胞百分比相關，但與年齡，性別，突變計數，細胞遺傳風險或分子遺傳風險無關。並且該模塊與較差的無病生存期（DFS）和OS有較高的關聯，因此選擇進行進一步的分析。

2.3黃色模塊中每個基因的預後意義

通過單變量Cox比例風險回歸，黃色模塊中共有43個基因與OS顯著相關。其中，12個lncRNA和31個mRNA的高表達與OS較差相關（圖5）。然後對這些lncRNA和mRNA進行進一步的構建lncRNA或mRNA預後風險模型。

圖5.基於黃色模塊中基因表達的生存分析

2.4 lncRNA預後風險模型的建立

通過多變量Cox比例風險回歸分析，作者建立了3-lncRNA預後風險模型來預測AML患者的OS，風險評分=（0.006899×SH3TC2-DT的表達值）+（0.00026×AF064858.1的表達值） +（0.016446×AL133353.1的表達值）（表1）。其中SH3TC2-DT是與預後最相關的lncRNA（表1）。

表1. lncRNA預後風險評分模型

根據風險評分的中位數，148例患者被分為高危（N = 74）和低危（N = 74）組（圖6A–C）。高危患者的OS顯著更低（圖6D）。多因素Cox回歸分析顯示，年齡和lncRNA風險評分是影響OS的獨立預後因素。lncRNA風險評分對生存的影響較大（圖6E）。ROC曲線下的面積為0.664，表明該風險模型具有較高的預測價值（圖6F）。繪製Nomogram以可視化多元Cox回歸分析的結果（圖6G）。此外，Kaplan–Meier曲線還證實這三個lncRNA是OS的預測指標（圖5A–C）。

圖6.lncRNA的Cox比例風險回歸分析

2.5 mRNA預後風險模型的建立

為了提高預後風險模型的預測準確性，首先進行了LASSO回歸分析，並從黃色模塊中具有預後價值的31個mRNA中選擇了四個mRNA（SH3TC2，ENPP2，TMEM273和PRDM16）進行進一步分析。通過多變量Cox比例風險回歸分析，確定了一個3-mRNA預後風險模型來預測AML病例中的OS，風險評分=（0.000612×SH3TC2的表達值）+（0.000507×ENPP2的表達值）+（ 0.000277×TMEM273的表達值）（表2）。

表2.mRNA預後風險評分模型

同樣地，根據風險評分的中位數，148例患者被分為高危（N = 74）和低危（N = 74）組（圖7A–C）。高危組患者的OS率顯著更低（圖7D）。多因素Cox回歸分析顯示，年齡，白細胞計數，分子風險和mRNA風險評分是影響OS的獨立預後因素。mRNA風險評分對生存的影響更大（圖7E）。ROC曲線下的面積為0.744，表明該風險模型具有較高的預測價值（圖7F）。最後，繪製Nomogram以可視化多元Cox回歸分析的結果（圖7G）。此外，Kaplan–Meier曲線還證實了這三種mRNA是OS的預測指標（圖5D–F）。

圖7.mRNA的Cox比例風險回歸分析

2.6 SH3TC2-DT / SH3TC2基因對是AML的獨立預後因素

在這一部分作者研究了SH3TC2-DT和SH3TC2表達的臨床意義。該研究表明，SH3TC2-DT和SH3TC2在FLT3突變AML樣本中協同高表達（圖8A，9A），表明SH3TC2-DT可能在AML發病過程中調節SH3TC2表達。並且SH3TC2-DT或SH3TC2的高表達與OS差有關（圖8B，9B）。兩者的ROC曲線都顯示出較高的預測值（圖8C，9C）。多變量Cox回歸分析顯示SH3TC2-DT和SH3TC2表達均為獨立的預後因素（圖8D，9D）。此外，應用邏輯回歸分析將SH3TC2-DT / SH3TC2基因對與臨床特徵相關聯，發現SH3TC2-DT和SH3TC2的高表達均與較高的WBC計數，分子遺傳風險以及FLT3突變有關。SH3TC2的高表達也與年齡有關（表3、4）。

表3. SH3TC2-DT表達與臨床特徵之間的關聯（logistic回歸）

表4. SH3TC2表達與臨床特徵之間的關聯（logistic回歸）

GSEA顯示，伴有FLT3-ITD的AML基因集在SH3TC2-DT和SH3TC2高表達表型中富集（圖8E、9E）。

圖8. SH3TC2-DT表達與總生存率和基因集富集的關係

圖9. SH3TC2表達與總生存率和基因集富集的關

作者發現與幹細胞特性或白血病發生相關的TF顯著富集於SH3TC2高表達組和SH3TC2低表達組之間的DEG，表明這些TF 可能是AML中SH3TC2的潛在靶標（圖10）。

圖10. TFs 調控網絡

最後就是驗證部分了，作者分析了BeatAML（Vizome）數據集，發現SH3TC2-DT和SH3TC2在FLT3突變AML中均顯著高表達。此外， GSE37642-GPL570還顯示，SH3TC2的高表達與AML中OS差有關。

好啦，這篇文章的內容就這麼多啦~總結一下文章是總-分-總的模式：1、篩選FLT3野生型和突變型白血病差異因子，構建lncRNA、mRNA共表達網絡，篩選預後marker；2、分別構建lncRNA、mRNA預後風險評分模型；3、篩選疾病關鍵的lncRNA-mRNA調控軸生存分析；4、外部數據驗證。內容該有的都有，故事完整連貫，再加點其它分析（eg：浸潤、免疫治療等）就更完美了。話不多說心動嗎，心動不如行動：