四倍體補償技術

2021-01-16 HACS

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四倍體互補實驗（TCA）有時候又被稱為兩步克隆法。具體操作是將四倍體(4n)胚胎與二倍體(2n)胚胎或胚胎幹細胞(Embryonic Stem Cells, ESC)聚合，並持續培養直至發育形成一個嵌合體。在這個發育過程中，四倍體(4n)胚胎與二倍體(2n)胚胎的發育是不同的，其中4n細胞主要參與胚外組織(如滋養層、卵黃囊膜、尿囊膜和胎盤等)形成而幾乎不參與其胚體的形成。從而可得到幾乎完全2n胚胎或ES細胞來源的小鼠，此即為四倍體補償技術。


那這個技術有什麼用呢？它能解決什麼問題？


目前，通過體細胞核移植獲得克隆鼠的效率較低，只有1%-4%。大多數的克隆胚死於著床後早期發育過程中，只有少部分可進行著床後發育，但是這一部分也會產生較大的胎盤和胎兒，最終造成難產。即使僥倖存活下的胎兒，大多數也因呼吸系統和血液循環系統存在問題而難以存活。

相比於體細胞核移植技術，四倍體補償技術則可以有效提高克隆效率，成為生產轉基因動物的有效的方法。目前，四倍體補償技術在驗證幹細胞全能性、研究基因功能、研究胚胎發育機理以及動物克隆上都有非常廣泛的應用。


4n胚胎的製作：一般採用電融合法製作4n胚胎，比如：電壓為100 v/mm，脈衝寬度為50μs，脈衝次數為2次時，融合率可達到95.27%。


相關指標：



囊胚率表型
Oct-42n
94.41%核小,細胞數目多高
4n
93.42%核大,細胞數目少低

P>0.05IF實驗IF實驗


4n胚胎中Oct-4、Nanog mRNA水平雖高於2n胚胎,但差異不顯著(P>0.05)。Bax mRNA水平高於2n胚胎(P<0.05)，Bcl-2 mRNA水平與2n胚胎相比差異不顯著。


當胚胎發育至4-8細胞期時，進行ES細胞注射，每枚胚胎注射6-8個細胞。或發育至囊胚時，每枚胚胎注射15個左右ES細胞。


4-8細胞期注射優於被廣泛應用的囊胚注射。獲得嵌合胚後移植入假孕母鼠體內。選取子宮膨大，有球狀突起的母鼠培養。對小鼠剖腹產取足月嵌合體小鼠,，對嵌合鼠各組織進行檢測,在其心臟、肝臟、大腦和睪丸中檢測ES細胞所帶標籤，證實ES細胞確實參與胎兒發育。



用TCA證明ips具有ES同等發育潛能


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簡版：



2C電融合為一個細胞，得四倍體胚胎。

四倍體胚胎發育至囊胚後只能發育形成胚外組織

四倍體胚胎與ESCs形成嵌合胚胎時，ESCs分化形成胎兒正常發育所需的各個組織器官，最後生下的小鼠就完全來源ESCs。（這是驗證ESCs發育上多分化潛能性最好的方法和途徑。）



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