中美科學家揭開哺乳動物流產之謎

　　中國科學家利用誘導多能幹細胞（iPS細胞）培育出的克隆豬。（劉通宇/圖）

　　絕大多數克隆動物在胚胎發育的早期即告流產，中美兩國科學家的一項最新研究表明，與胚胎發育相關的一個重要基因的沉默是哺乳動物早期流產的關鍵原因，這一發現也為解決人類自發流產難題提供了新思路。

　　2018年11月1日，《美國科學院院刊》（PNAS）在線發表了中國和美國科學家的最新研究成果，揭示了一個與胚胎發育相關的重要基因RTL1的沉默是哺乳動物早期流產的關鍵原因；通過RTL1基因的補償表達，可顯著提高誘導多能幹細胞（iPS細胞）克隆動物的繁殖效率，也為解決人類自發流產難題提供一個新的思路。

　　克隆動物易流產

　　經過基因改造的克隆豬，可為人類提供續命的器官，也可精準模擬人類遺傳病或癌症，以便科學家弄清楚這些複雜疾病的致病機理，或用以驗證新藥，已成為生命科學研究中最令人期待的熱門領域之一。

　　一般情況下，克隆豬是由體細胞經過核移植操作培育出來的，不過基因修飾克隆豬則先需要對體細胞進行多次複雜的基因操作，絕大多數體細胞比較脆弱，壽命短，難以承受反覆「折騰」，因此利用體細胞很難培育出符合人們期望的基因修飾克隆豬，這正是目前該研究領域的主要難點之一。

　　2006年，日本科學家山中伸彌教授團隊向小鼠的一種皮膚細胞——成纖維細胞中轉入四個轉錄因子基因，使得已高度分化的體細胞重新獲得全能性，即可分化成體內的任意一種細胞，包括神經細胞和生殖細胞等，這種幹細胞就是誘導多能幹細胞。山中伸彌教授也因為這一發現，與體細胞克隆技術的主要發明人、英國生物學家約翰·格登教授一起分享了2012年諾貝爾生理學或醫學獎。

　　iPS細胞技術誕生後，科學家很快發現其在人類治療性克隆、輔助生殖或基因修飾克隆動物等領域具有廣闊的應用前景。2009年，中國科學院動物研究所周琪研究員首次利用iPS細胞（誘導性多能幹細胞）培育出健康小鼠，該研究成果入選《時代》周刊2009年度十大醫學突破。2018年10月，周琪院士作為通訊作者之一參與的一項重要研究成果再次引發關注，研究人員用兩個雄性小鼠的iPS細胞，培育出了健康小鼠，再次突破了同性生殖障礙。

　　目前，國際上與iPS細胞相關的大多數研究成果均集中在小鼠身上，而利用豬、牛、羊等大動物的iPS細胞培育出健康克隆動物則鮮有報導。2012年12月，在中國農業大學李寧院士領導下，全國十幾家科研單位集中攻關，首次在國際上利用豬的iPS細胞培育出克隆豬。之後，國際上再無iPS細胞克隆豬誕生，更沒有iPS細胞克隆牛、羊等其它大動物的消息。

　　為什麼iPS細胞克隆大動物如此難以培育呢？研究表明，iPS細胞核移植囊胚發育率可達10~30%，與體細胞克隆差不多，但是將這些源自iPS細胞的克隆胚胎移植到代孕母畜體內後，絕大多數克隆胚胎在胚胎發育的早期即告流產。

　　大量的動物研究數據表明，體外生產的胚胎相比體內胚胎都具有更高的流產率。例如，自第一隻體細胞克隆哺乳動物多利綿羊誕生20多年以來，已有20多種哺乳動物得到克隆後代，包括2018年初中國科學院神經科學研究所培育的世界首例體細胞克隆猴，但是體細胞克隆技術的流產問題一直沒有得到顯著改善，不同動物的克隆胚胎流產率均在90%以上。

　　流產的關鍵原因

　　研究發現，表觀遺傳修飾的異常被認為可能是導致哺乳動物流產的一個重要原因，尤其是輔助生殖技術過程中胚胎的體外培養和相關操作會導致甲基化修飾等表觀遺傳修飾異常，從而引發流產。

　　這是因為動物發育過程是從單細胞受精卵，發育成胚胎幹細胞，幹細胞進一步分化成各種功能的體細胞，後者再組成各種組織器官。儘管同一動物內每個細胞的基因組都完全一樣，但是控制細胞分化和發育的基因因為受到某些表觀遺傳修飾，包括甲基化修飾、組蛋白修飾、基因印記、X染色體失活等，從而表現出不同的命運。如果說基因組決定細胞能表達什麼樣的功能蛋白，那麼表觀遺傳修飾則決定了每個基因什麼時候表達，表達水平高低等，後者就像給不同的胚胎細胞提前設置了「指令」，當胚胎細胞接到的「指令」是發育成神經細胞，那它只能發育成神經細胞，如果「指令」是心肌細胞，那它也只能發育成心肌細胞，如此，這些胚胎細胞會按照各自的「指令」發育成各種不同的組織器官。

　　體細胞克隆和iPS細胞克隆等體外輔助生殖技術都涉及已高度分化的體細胞，要讓這些體細胞能發育成動物個體，重新恢復類似胚胎幹細胞的全能性，則需要讓這些細胞「恢復出廠設置」，使一些細胞分化關鍵基因的表觀遺傳修飾模式得以逆轉，但是有些基因的表觀遺傳修飾比較頑固，致使這些基因表達異常，最終導致動物流產。到底哪些基因在「搗亂」呢？

　　為了找到哺乳動物流產的主要原因，來自中國農業大學的吳森教授、趙要風教授、杜旭光博士團隊與2007年諾貝爾生理或醫學獎獲得者、美國猶他大學Mario Capecchi教授合作，以豬iPS細胞克隆胚胎作為實驗對象，建立了研究哺乳大動物早期流產的模型。中科院動物所北方大動物研究基地、中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所、重慶市畜牧科學院等單位的科學家也參與了這項工作。

　　中美研究人員首先從豬的胎兒皮膚組織分離出成纖維細胞，借鑑山中伸彌的方法，向豬成纖維細胞加入四種轉錄因子，誘導其發育成多能幹細胞，並通過核移植獲得克隆胚胎。但是，當研究人員將這些克隆胚胎移植到代孕母豬子宮內後，流產率接近100%，特別是在早期妊娠（25-45天）階段，流產率高達90%以上，顯示胚胎發育早期是克隆胚胎能否發育到期的關鍵期，而體細胞克隆胚胎則能獲得健康存活的仔豬。

　　研究人員進一步選取成纖維細胞、iPS細胞，以及這兩種細胞來源的克隆胎兒和胎盤進行了全基因組甲基化測序等分析，發現豬基因組甲基化修飾模式與小鼠和人類的存在顯著差異；同時發現了13個影響豬胚胎早期發育的重要印記基因。這些印記基因都容易受到甲基化等表觀遺傳修飾，有一些是受到父親基因的標記，稱為父本印記基因。研究發現，其中一個父本印記基因RTL1的異常沉默與豬iPS細胞克隆胚胎的發育異常極其相關，可能是克隆胚胎流產的重要因素。

　　RTL1是逆轉錄轉座子衍生蛋白，對於哺乳動物胚胎微血管和胎盤形成至關重要，而且在正常胚胎發育後期表達水平會隨之提高，但是這些流產克隆胚胎RTL1含量卻顯著偏低，甚至檢測不到。研究人員不僅在豬的克隆胚胎髮現這一現象，在牛的體細胞克隆和體外受精胚胎中也發現了類似現象，這表明RTL1基因表達異常是哺乳動物流產的關鍵原因。

　　為了證明上述推論，研究人員進行了RTL1基因敲除和補償表達試驗。當利用基因編輯技術將iPS細胞的RTL1基因敲除時，這些iPS細胞克隆胚胎移植到代孕母豬體內後無一發育到出生；當將RTL1基因轉入這些iPS細胞克隆胚胎中，讓其表達RTL1蛋白以填補細胞內該蛋白的空缺，結果顯示，這些RTL1得到補償的iPS細胞克隆胚胎可成功發育出克隆小豬，克隆豬的出生存活率與體細胞克隆的效率相當，遠遠高出之前iPS細胞克隆豬出生率；而未轉入RTL1基因的iPS細胞克隆胚胎則全軍覆沒。這些研究進一步證明，RTL1基因的表達異常是克隆動物容易流產的關鍵原因，同時也為解決哺乳動物甚至人類的流產問題提供了較好的思路。

　　或為人類流產提高解決方案

　　隨著我國人口政策的調整，預計在未來幾年內我國新生兒的數量將會出現大幅的增長，但是隨之而來的產婦高齡化、環境汙染及工作壓力引起的男性精子活力低等現實問題，導致受精胚胎在植入後時期發育阻滯的概率大大增加。據國家衛生健康委員會數據顯示，從不同地區、不同階層及不同年齡的取樣分析，自然流產的發生率在15%-40%，約75%發生在妊娠16周以前，發生於妊娠12周前者佔62%。也就是說，在人類的妊娠終止事件中約有三分之二的胚胎在三個月前發生自發流產。

　　其實，人類輔助生殖技術也面臨同樣的流產難題。自1978年第一個試管嬰兒誕生以來，體外受精（IVF）、卵胞漿內單精子注射（ICSI）、胚胎移植等輔助生殖技術已在全球培育出超過650萬個試管嬰兒。據一份商業諮詢報告顯示，2016年-2024年，全球試管嬰兒需求量複合年增長率將保持在6%以上。

　　但是，體外受精等輔助生殖技術仍然存在一些問題，如出生存活率偏低。據美國繁殖醫學協會最新數據顯示，美國體外受精胎兒出生成活率約為37%，這與年齡有較強的負相關，如35歲以下孕婦的胎兒出生成活率可達54%，而42歲以上孕婦的胎兒出生成活率不到4%，出生存活率隨著孕婦年齡增長而下降。

　　有趣的是，研究人員分析發現，人類妊娠早期自發流產胚胎的RTL1含量偏低，同時他們還注意到RTL1基因的表達會隨著母親年齡的增加而降低。此外，超過10%的男性不孕患者精子在RTL1基因及周邊序列存在異常的DNA甲基化模式。所有這些導致人類胚胎流產的數據都支持了該研究的假設，即RTL1基因可能是人類自發性流產的重要表觀遺傳決定因素。

　　通過進一步研究RTL1的作用機制和調控網絡，有可能開發出針對RTL1基因靶點的藥物，將有望降低孕婦的自發流產率，為日益增多的高齡孕婦及家庭帶來新的希望。