從完整肌腱到單纖絲:偏振紅外光譜強勢助力膠原蛋白的分子取向研究

2020-11-22 中國教育裝備採購網

　　在過去的十年裡，紅外（IR）光譜已被廣泛應用於哺乳動物組織中的膠原蛋白研究。對有序膠原蛋白光譜的更好理解將有助於評估受損膠原蛋白和疤痕組織等疾病。因此，利用偏振紅外光研究膠原蛋白（I型膠原和II型膠原）的層狀結構和徑向對稱性逐漸成為研究熱點。目前，基於焦平面陣列檢測器的偏振遠場（FF）傅立葉變換紅外（FTIR）成像、偏振遠場（FF）、光學光熱紅外（O-PTIR）以及散射型掃描近場光學顯微鏡（s-SNOM）的納米紅外技術在膠原蛋白領域得到廣泛應用。偏振遠場（FF）方法可應用於完整肌腱的截面，其纖維平行且垂直於偏振光排列。光學光熱IR紅外（O-PTIR）和納米傅立葉變換紅外（nano-FTIR）方法則應用於直徑為100~500 nm的原纖維，在生物聚合物上共同實現互相印證和互補的結果。

　　通常，I型膠原蛋白在偏振紅外光下反應不同。採用基於焦平面陣列（FPA）檢測的遠場傅立葉變換IR（FF-FTIR）對其進行成像時，受制於蛋白質醯胺I和II的紅外特徵峰吸收帶的波長（~7 μm）的解析度極限，難以獲取高質量的成像結果。而採用散射型掃描近場光學顯微鏡（s-SNOM）方法的納米級FTIR（nano-FTIR）光譜技術，可以獲得空間解析度約為20nm的紅外光譜，解決了受限於IR輻射波長的限制（通常5-10 μm）。此外，採用光學光熱紅外技術（O-PTIR）成像和光譜學的方法，也可以擺脫紅外波長的限制，實現亞微米（500nm）的空間解析度，為完整組織和原纖維膠原蛋白的研究打開了一個新窗口。

　　近期，在Kathleen M. Gough等人的研究中[1]，作者採用基於光學光熱紅外（O-PTIR）專利技術的PSC非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統 mIRage對樣品〜500 nm單點區域收集振動光譜，如圖1所示。該光學光熱紅外（O-PTIR）技術的工作原理是光熱檢測，其中紅外量子級聯雷射器（QCL）激發樣品在1800–800 cm-1光譜範圍內的分子振動。產生的光熱效應通過短波長探測雷射器檢測。圖2A-B中的光譜表明，固有的雷射偏振所獲得的高對比度所產生的光譜與使用FTIR焦平面陣列和偏振器組合進行的光譜測試近乎一致。並且對於安裝在玻璃顯微鏡的不同載玻片，樣品均獲得了具有良好SNR的高質量光譜。

圖1. 完整肌腱的光學光熱IR（O-PTIR）光譜，〜500 nm測量點。（A）利用線性偏振量子級聯雷射器（QCL）從CaF2窗口在平行和垂直兩個不同方向上獲得光譜。插入的可視圖像顯示了6個採譜位置；比例尺= 70 µm。（B）對比從CaF2（頂部）和玻璃（底部）載玻片在線性偏振QCL的平行和垂直方向上獲得的光譜。

　　光學光熱紅外（O-PTIR）技術可以通過在載物臺上輕易地旋轉樣品來測試平行和垂直於紅外雷射偏振方向的光譜。並利用光學光熱紅外（O-PTIR）技術在幾個單一頻率下對原纖維成像，以獲得表觀物理寬度的確定性估計。如圖2右側所示，在垂直方向上， 1655 cm-1處記錄的單波長圖像的紅黃帶表明該原纖維的寬度不超過500 nm。該尺寸將目標物標定為真正的原纖維，並且可與紅外s-SNOM實驗中檢測到的300 nm原纖維相當。光學光熱紅外（O-PTIR）技術與nano-FTIR的測試結果相互印證，反映了「原纖維」寬度的標準範圍。此外作者觀察到，來自原纖維的醯胺I和II譜帶比完整肌腱的窄，並且相對強度和譜帶形狀都發生了變化。這些光譜反映出在偏振紅外光下正常I型膠原纖維的更多有用信息，並可作為研究膠原組織的基準。

圖2. 從CaF2窗口利用O-PTIR測試控制肌腱原纖維獲得的光譜。用平行於雷射偏振的原纖維獲得的頂光譜（紅色）；藍色是垂直方向上的光譜。右側是在垂直方向基於1655 cm-1的單波長圖像。正方形表示光譜採集位置。比例尺= 1 µm。

　　與基於焦平面陣列檢測器的偏振遠場傅立葉變換紅外（FF-FTIR）光譜相比，光學光熱紅外（O-PTIR）具有更高的空間解析度，且可提供單波長光譜。使用FF-FTIR FPA探測往往包括其他非膠原材料。同時，光學光熱紅外（O-PTIR）還可以提供偏振平行於原纖維取向的原纖維光譜。這也是光學光熱紅外（O-PTIR）和納米FTIR光譜對直徑為100~500 nm的膠原原纖維給出證實性和互補性結果的首次證明。綜上所述，這些結果為進一步研究生物樣品中的膠原蛋白提供了廣闊的基礎。

　　參考文獻：

　　[1]. Gorkem Bakir, Benoit E. Girouard,  Richard Wiens, Stefan Mastel, Eoghan Dillon, Mustafa Kansiz, Kathleen M. Gough, Molecules 2020, 25, 4295; doi:10.3390/molecules25184295.

　　相關產品：

　　非接觸式亞微米分辨紅外拉曼同步測量系統—mIRage：https://www.caigou.com.cn/product/20191022131.shtml

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