Wnts是一個分泌性脂質修飾的糖蛋白家族，參與調控形態發生、細胞乾性和細胞命運決定。細胞分泌Wnt，通過局部作用達到附近的受體細胞，與多種細胞表面受體相互作用，包括人Frizzleds家族、Wnt共受體如LRP5/6和受體酪氨酸激酶ROR2。Wnt-受體互作可誘導不同的下遊信號反應，包括穩定β-catenin、調控基因表達、激活JNK和調控細胞極性等。
Wnt中一個極為重要的生物學特徵是單不飽和棕櫚油酸酯（PAM）與絲氨酸殘基共價連接，而該絲氨酸殘基基本上在所有Wnt中保守。這種O-醯化修飾使Wnt蛋白具有高度的疏水性，需依賴載體進行細胞內和細胞間運動。Wnt棕櫚酸醯化修飾是在內質網上被膜結合的O-乙醯基轉移酶（PORCN）所催化。醯化後，Wnt能夠與內質網上保守的膜轉運蛋白（稱為WLS、Evi和GPR177）結合【1】，用於跨細胞內轉運和分泌。WLS是整合型的膜蛋白，預測有8個跨膜螺旋，有一個延展的管腔環（這是Wnt結合所必需的），胞質C端有一個ER再循環序列。WLS預測與G蛋白偶聯受體同源，又被稱作GPR177。PORCN催化的乙醯化對於Wnts與WLS結合是必需的【2】，突變Wnt的棕櫚酸醯化位點、抑制PORCN和下調WLS表達都能抑制Wnt從ER的離開和分泌，從而影響Wnts的功能。從內質網到細胞質膜，Wnt-WLS複合物可能將Wnt轉移到細胞表面蛋白聚糖、可溶性轉運蛋白、細胞質或外泌體中。最終，Wnts被遞送到Frizzled（FZD）並激活下遊信號，該過程依賴於O-PAM修飾。WLS可從質膜再循環回內質網，進行下一輪Wnt轉運循環。那麼，一個新的棕櫚酸醯化的Wnt如何被PORCN轉送給WLS？Wnt、O-PAM和WLS如何組裝成轉運高效的複合物？Wnt如何從WLS轉移到各種轉運體和鄰近細胞的FZD？這些問題都還有待進一步的研究。
近日，來自杜克大學醫學院的David M. Virshup和哥倫比亞大學歐文醫學中心的Filippo Mancia在Cell雜誌上發表文章Structural Basis of WLS/Evi-Mediated Wnt Transport and Secretion，解析了棕櫚酸醯化的WNT8A-WLS的3.2Å冷凍電鏡結構。分析發現，WLS膜結構域與GPCRs有類似的結構同源性。Wnt髮夾（hairpin）結構插入WLS膜結構域的保守疏水腔中，兩個螺旋之間的棕櫚酸醯化修飾深入到磷脂雙層。而另一個Wnt髮夾上高度保守殘基的構象轉換有助於其轉移到鄰近細胞的受體上。
研究人員選擇人源WNT8A和人源WLS進行探索，首先驗證棕櫚酸醯化依賴的WNT8A-WLS複合物的形成對於Wnt轉運到細胞表面是必需的。隨後解析了解析度為3.2Å的冷凍電鏡結構，並構建了一個模型，該模型包含WLS（共541個胺基酸）的胺基酸殘基4-496，以及WNT8A（共351個胺基酸）的胺基酸殘基30-337。模型缺乏WLS C端尾部（殘基497-541）和WNT8A的3個環（115-125、223-240和279-287），這些部分較為無序。WNT8A-WLS複合物結構顯示WLS具有兩個獨特的組分：一個是8個跨膜（TM）螺旋組成的完整的膜結構域，N和C末端位於細胞質側；另一個是位於TM1和TM2之間的球狀管腔結構域（WLS LD），這是Wnt結合所必需的。WLS LD是由8個反向平行的β片層組成的緊湊結構，組裝成一個β三明治。此外，WLS LD與參與脂滴形成的ER蛋白seipin具有結構同源性。
複合物結構顯示，WNT8A的Asn103和Asn262具有N-連接的糖基化修飾。Asn262連接的聚糖非常靠近假定的LRP5/6結合位點；Asn103連接的聚糖非常靠近WLS的廣泛親水表面，或介導該區域兩種蛋白質之間的相互作用，突變Asn103則降低WNT8A的產生和信號活性，提示這個位點的聚糖具有重要的功能作用。當WNT8A與WLS形成複合物時，其結構具有高度保守的核心：由五個螺旋構成，其中三個髮夾環從中延伸，兩個環——髮夾2和3組裝成β摺疊股，形成β摺疊。兩者之間的互作界面是非常廣的，包埋表面具有2403Å2，有助於兩者形成緊密結合。Wnt-FZD CRD結構中，Wnt髮夾1直接與髮夾2相互作用；而在WNT8A-WLS結構中，髮夾1和髮夾2被WLS LD的第一個β摺疊所分開。髮夾1延伸了兩個保守的色氨酸殘基——Trp127和Trp129，和WLS TM1和TM2頂部高度保守的殘基（Ser104、Phe107、Asn227和Gly229）進行接觸。髮夾2由兩個二硫鍵穩定，頂端攜帶PAM與絕對保守的Ser186結合。髮夾2深入WLS TM結構域，並與中心疏水腔形成多個接觸，這個中心疏水腔也由保守殘基構成。在WLS Gly305的幫助下，PAM依次穿過TM螺旋4和5之間的狹窄疏水通道。WNT8A Ser186的PAM酯鍵主要是通過WLS Asp301和WLS Arg357之間的離子相互作用進行配位。突變WNT8A髮夾1、髮夾2及WLS上相應結合位點均損傷Wnt信號，減少Wnt分泌。即WLS和Wnt髮夾1、2之間的相互作用對於新合成的棕櫚酸醯化Wnts的分泌是非常重要的。Wnt的髮夾3從螺旋核心到WLS LD的上部形成一個拱形，深入到一個保守的疏水性口袋中。對比Wnt-FZD CRD和Wnt-WLS結構發現，髮夾3中Phe316和Trp318的取向不同，這些殘基的側鏈在這兩種結構之間發生明顯的變化，這表明當Wnt改變結合夥伴時，髮夾3或起到分子開關的作用。此外，突變WNT8A髮夾3中保守的WCC基序不影響Wnt的分泌，但損傷其信號激活；而且髮夾3被3個高度保守的二硫鍵所穩定，而這些二硫鍵的形成對於棕櫚酸醯化和WLS互作都不是必需的，而對WNT3A與FZD CRD的結合是必需的。即Wnt髮夾3對於Wnt與FZD CRD互作更重要。
對比WNT8A-WLS和xWnt8-FZD的結構，發現Wnt的α螺旋核心基本沒有變化，但髮夾環明顯有移動。WNT8A的髮夾1和髮夾2被WLS LD分開，而Wnt-CRD中兩個髮夾緊密結合形成一個β摺疊。Wnt髮夾的這種靈活性可能有助於Wnt和多種蛋白結合，如WLS、FZD CRD、PORCN、ROR1等。WLS TM域中深埋著一個大洞，這個空間在頂部向管腔側開放，通過TM螺旋6和7之間的間隙向脂類雙層開放，這可能是棕櫚酸醯化的Wnt髮夾2進入和退出的潛在途徑。進一步分析發現，WLS與G蛋白偶聯受體具有結構同源性，或可作為靶點用於抑制Wnts蛋白的分泌。
總的來說，研究解析了Wnt-WLS複合物的結構，從結構的角度揭示了Wnt分泌過程的機制，或為抑制Wnts蛋白分泌提供潛在的藥物靶點。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.038
參考文獻
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2. Coombs, G.S.,Schmitt, A.A., Canning, C.A., Alok, A., Low, I.C., Banerjee, N., Kaur, S.,Utomo, V., Jones, C.M., Pervaiz, S., et al. (2012). Modulation of Wnt/b-catenin signaling and proliferation by a ferrous iron chelator withtherapeutic efficacy in genetically engineered mouse models of cancer.Oncogene31, 213–225.
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