撰文 | 晨晨
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2020年12月14日，BMC Biology 期刊在線發表了何承訓研究團隊題為「Feedback inhibition of AMT1 NH4+-transporters mediated by CIPK15 kinase」的研究論文，揭示了植物銨轉運蛋白ATM1活性的反饋抑制由蛋白激酶CIPK15所介導，通過對C端保守的蘇氨酸殘基磷酸化調節NH4+的攝取和積累。
銨（NH4+）是氮素的主要存在形式之一，也是細菌、真菌和植物的重要氮源。當NH4+供應超過最佳範圍時則會產生毒害，限制或抑制植物生長、發育和作物產量。植物銨轉運蛋白（ATMs）家族是負責NH4+攝取的關鍵轉運蛋白，其活性受變構反饋抑制的調控，由胞質內C端蘇氨酸的磷酸化（CCT）所介導。然而，目前對負責NH4+依賴性ATMs磷酸化的完整調控通路尚不完全清楚，在此推測在NH4+積累條件下，可能存在特定激酶發揮關鍵調節作用。
1. CIPK15抑制ATM1;1和ATM1;3的活性
CBL互作蛋白激酶CIPK，也被稱為SNF1相關激酶（SnRK），已知可調節不同類型轉運蛋白及陰離子通道蛋白的活性。為研究CIPKs是否具有ATM調控作用，研究者系統篩選了能夠影響非洲爪蟾卵母細胞ATM1;1（ATM家族成員）活性的CIPKs。通過爪蟾卵母細胞ATM1;1雙電極電壓鉗（TEVC）及在酵母中利用ATM1;3的NH4+轉運體活性傳感器AmTryoshka綜合分析表明，CIPK15能夠在不同異源系統中發揮作用，並特異性抑制ATM1;1和ATM1;3轉運活性。
2. CIPK15與不同ATMs成員互作
為驗證CIPK15是否與NH4+營養有關，在野生型根中添加1mM NH4+後對CIPK15的表達進行檢測，結果顯示CIPK15受NH4+的顯著誘導。為檢測CIPK15是否與ATM1互作，分裂泛素化酵母雙雜、β-半乳糖苷染色及菸草葉片中雙分子螢光互補分析結果表明，CIPK15可以與ATM1家族成員特異性互作（圖1）。
圖1. CIPK15與ATM1;1互作
3. CIPK15突變導致15NH4+吸收活性提高和NH4+積累量增加
ATMs包含多個磷酸化位點，其中緊隨跨膜結構域XI的保守CCT中的T460在ATM1的變構調節中起關鍵作用。通過對兩個CIPK15敲除突變體進行檢測並對ATM1;1磷酸化狀態進行分析，得知CIPK15為NH4+觸發的ATM1磷酸化所必需。基於該結果，為確定CIPK15是否影響植物對銨的吸收及對NH4+的毒性反應，將cipk15突變體暴露於NH4+環境下，發現突變體對NH4+敏感，而對NO3-不敏感。經NH4+預處理後，cipk15突變體中NH4+積累量明顯增多。15NH4+攝取分析同樣表明，cipk15突變體中對NH4+吸收顯著增加（圖2）。這些結果表明CIPK15對於ATM1介導的NH4+攝取抑制是必需的。
圖2. cipk15突變體中NH4+的含量與轉運
4. CIPK15是擬南芥NH4+耐受的關鍵因子
高水平NH4+對初生根的生長產生負面影響。為檢測cipk15突變體中NH4+的高積累和NH4+誘導的ATM1;1磷酸化是否影響NH4+敏感性，對NH4+存在與否是的根系生長情況進行分析，結果發現cipk15突變體的初生根長較野生型更短。NH4+類似物甲基銨（MeA）由ATMs特異運輸，實驗結果發現cipk15突變體同樣對MeA敏感，這進一步說明CIPK15為ATM1;1活性抑制所必需（圖3）。綜上表明當根系暴露於NH4+或MeA時，CIPK15活性在限制ATM1;1對NH4+的吸收方面發揮關鍵作用。
圖3. cipk15突變體對NH4+及MeA表現出超敏表型
本研究鑑定了NH4+反饋抑制網絡中的一個關鍵成分，即CIPK15蛋白激酶，它直接與ATM互作，使C端保守的蘇氨酸磷酸化，從而調節銨的攝取和對外界NH4+濃度的依賴性。在該領域，懸而未決的問題是植物如何感知銨濃度以及如何激活CIPK15。據報導，CIPK15參與ABA信號通路和ERF7的磷酸化，且CPK32被證明在ATM活性的調節中發揮作用，這均對以後的研究具有重要指導和借鑑意義。
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