Moleculer Cell: IKK抑制RIPK1介導的細胞死亡效應機制研究

2020-12-05 生物谷

2015年10月9日 訊 /生物谷BIOON/ --腫瘤壞死因子（TNF-a）是一類促炎性細胞因子，關於它的功能與分子機制已經有十分完善的研究結果。TNF作用於細胞膜上的受體TNFR1從而引發一系列的細胞內信號轉導過程，從而引起細胞的炎性反應或者細胞死亡。在TNF信號通路中，轉錄因子NF-kB起著不可或缺的作用：正是NF-KB的激活導致的下遊一系列基因的表達使得細胞進入炎性狀態。在NF-kB上遊有一類起著調節作用的蛋白激酶複合體叫做IKK，它由三個蛋白亞基組成：IKKα，IKKβ，IKKγ。其中，IKKγ起著調節IKK複合體活性的作用。

TNFR1激活後會形成同源三聚複合體，並且能夠吸引下遊的蛋白（TRADD,RIPK1，TRAF2，cIAP1/2）形成蛋白複合體cIAP1/2是E3泛素連接酶，它們能夠將RIPK1特定位點泛素化，泛素化後的RIPK1能夠進一步募集NEMO（IKKγ）並將其也泛素化；另外，泛素化的RIPK1也能夠募集TAB2/3與下遊激酶TAK1，TAK1最終將IKK磷酸化並激活，引起信號的釋放。NF-kB能夠促進一些抗凋亡基因的表達，比如c-FLIP，從而抑制TNFR1信號本身導致的凋亡效應。

目前已知的RIPK1引起的細胞死亡主要包括由FADD-caspase8複合體轉導的細胞凋亡與RIPK3-MLKL複合體介導的細胞壞死。雖然我們已經清楚RIPK1的泛素化最早是由cIAP引起的，但激活後的RIPK1如何調控細胞死亡的分子機制目前並不清楚。針對這一問題，來自比利時的Mathieu J.M. Bertrand課題組進行了相關研究，其結果發表在最新一期的《Molecular Cell》雜誌上。

首先，作者利用NEMO-/-/WT小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)作為研究對象，分別進行TNF-a/TNF-a+Nec1（一種RIPK1抑制劑）/對照處理，並比較其細胞死亡情況。結果顯示，相比於野生細胞，NEMO敲除後的細胞對於TNF-a的刺激凋亡效應十分明顯，這說明NEMO有著保護細胞免受TNF-a致死效應的作用。

另外，作者發現在TNF-a與Nec-1聯合刺激的情況下，細胞死亡的程度明顯降低，這一結果暗示了TNF-a引起的細胞死亡與RIPK1有關。由於NEMO的主要作用是調節IKKα與IKKβ的活性，作者猜測是否這兩個亞基也參與了這一調控過程。之後，作者以IKKα-/-與IKKβ-/-MEF作為對象進行了相同的刺激實驗，結果顯示，單獨敲除任何一個亞基對於TNF-a的刺激的致死效應都不夠明顯。作者比較了IKKα-/- IKKβ-/-雙敲的MEF，得到了與NEMO-/-相似的實驗結果。這些結果表明的確IKKα與IKKβ能夠抑制RIPK1介導的細胞凋亡。

由於IKKα與IKKβ是絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，作者猜測是否這一保護作用依賴於它們的激酶活性。因此，作者利用物種不同類型的IKK酶活抑制劑進行處理，並進行上述刺激。結果顯示，藥物處理後的細胞在TNF-a的刺激下展現出類似於IKK敲除的致死效應。這一結果表明IKK的保護作用依賴於它的激酶活性。所以作者希望了解IKK的這一作用是否依賴於其下遊的NF-KB的活性。作者通過放線菌酮預處理抑制了NF-kB下遊基因的表達，實驗結果與上述並無太大區別。這一結果證實了IKK的作用不依賴於NF-KB的活性。

那麼IKK是如何影響RIPK1引導的細胞死亡事件的呢？之前的研究我們知道IKK與RIPK1存在物理作用。結合IKK的激酶屬性，作者們猜想IKK可能會磷酸化RIPK1從而抑制RIPK介導的死亡信號。通過生化實驗，作者發現在野生狀態下RIPK1存在磷酸化的狀態，這種狀態猶豫有高度泛素化的存在因而難以察覺。而在利用NEC-1抑制RIPK1本身激酶活性之後這一磷酸化並未消失，說明RIPK1的磷酸化不是由於自身磷酸化作用造成的。作者發現在IKK活性受損的條件下RIPK1的磷酸化同時受到了影響。這些結果說明RIPK1的磷酸化是由IKK催化導致的。隨後，作者通過一系列蛋白互作實驗證實：在RIPK1磷酸化的狀態下，RIPK1難以與FADD-caspase8形成穩定的複合體，因而難以介導凋亡的發生。

最後， 作者通過小鼠試驗也證明IKK的活性直接影響了RIPK1介導的細胞死亡的事件，並且證明這一效應不依賴於IKK下遊的NF-KB的活性。

綜上，作者通過一系列實驗說明在TNFR1下遊複雜的信號傳遞過程中，IKK可以不依賴於下遊的NF-KB而直接抑制RIPK1介導的細胞凋亡事件的發生。（生物谷Bioon.com）

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PMC:

PMID：

doi:10.1016/j.molcel.2015.07.032

NF-kB-Independent Role of IKKa/IKKb in Preventing RIPK1 Kinase-Dependent Apoptotic and Necroptotic Cell Death during TNF Signaling

Yves Dondelinger, Sandrine Jouan-Lanhouet, Tatyana Divert, Emilie Theatre，John Bertin, Peter J. Gough, Piero Giansanti, Albert J.R. Heck, Emmanuel Dejardin, Peter Vandenabeele, and Mathieu J.M. Bertrand

TNF is a master pro-inflammatory cytokine. Activation of TNFR1 by TNF can result in both RIPK1-independent apoptosis and RIPK1 kinase-dependent apoptosis or necroptosis. These cell death outcomes are regulated by two distinct checkpoints during TNFR1 signaling. TNF-mediated NF-κB-dependent induction of pro-survival or anti-apoptotic molecules is a well-known late checkpoint in the pathway, protecting cells from RIPK1-independent death. On the other hand, the molecular mechanism regulating the contribution of RIPK1 to cell death is far less understood. We demonstrate here that the IKK complex phosphorylates RIPK1 at TNFR1 complex I and protects cells from RIPK1 kinase-dependent death, independent of its function in NF-κB activation. We provide in vitro and in vivo evidence that inhibition of IKKα/IKKβ or its upstream activators sensitizes cells to death by inducing RIPK1 kinase-dependent apoptosis or necroptosis. We therefore report on an unexpected, NF-κB-independent role for the IKK complex in protecting cells from RIPK1-dependent death downstream of TNFR1.

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