細胞膜最簡單的磷脂雙分子層，行為複雜到超出你的想像（二）

2020-08-11 生物流

接上一篇文章：我們繼續：


科學家想到了什麼辦法來實時觀察細胞的胞吞胞吐過程呢？

辦法就是：將細胞膜標記上螢光蛋白，再拿到超高解析度的螢光顯微鏡下進行觀察。


  1. 超高解析度螢光顯微鏡

共聚焦顯微鏡（Confocal）的解析度可以達到150納米，超高解析度顯微鏡如受激發射損耗（stimulated emission depletion microscopy，STED）顯微鏡，也叫STED顯微鏡，解析度可以達到60納米甚至更低。

在時間解析度上，STED顯微鏡也可以達到33-100毫秒，也就是每1秒鐘拍照10-30張。這樣的解析度足夠滿足科學家們觀察細胞膜變化的動態過程。

普通光學顯微鏡的解析度受到光衍射的影響，只能達到半波長的解析度。而受激發射損耗顯微鏡（STED）屬於超高解析度顯微鏡，它打破了限制普通光學顯微鏡解析度的光衍射極限。

通俗地講，STED顯微鏡成像的原理是用一束環形光來幹涉抵消掉螢光衍射環的一部分，從而實現超高解析度。

由於在超高解析度螢光顯微鏡研究領域的貢獻，埃裡克·白茲格（Eric Betzig）、史蒂芬·黑爾（Stefan W. Hell）和威廉·莫爾納（William E. Moerner）三位科學家獲得了2014年的諾貝爾化學獎。

超高解析度顯微鏡除STED外，還有隨機光學重建（STORM）顯微鏡、全內反射螢光（TIRF）顯微鏡等，它們將螢光顯微鏡的解析度帶入了「納米時代」。


現在，螢光顯微鏡的解析度夠了，能夠觀察細胞膜的動態變化了。那麼，如何給細胞膜標記螢光呢？

要標記細胞膜，既可以從磷脂雙分子層入手，又可以標記膜上的蛋白質。


  1. 讓我們重新來看磷脂酶C——用螢光來標記磷脂酶C

磷脂酶C位於細胞膜上，並且它是位於兩層磷脂分子層的內層上，這個蛋白一部分在磷脂層中，另一部分在細胞內部。


既然磷脂酶C位於細胞膜，那麼，我們就可以通過表達基因的方式，將磷脂酶C的胞內區的PH結構與螢光蛋白（如mNeronGreen，GFP等）融合。這樣，螢光蛋白的位置就可以代表細胞膜的位置。

我們有了標記細胞膜的工具，即給磷脂酶C帶上螢光蛋白。只要觀察到螢光的變化，就能知道細胞膜的變化情況了。同時，現代科技又具備觀察活細胞的超高解析度顯微鏡。

在這種情況下，假如，給你兩片具有生物活性的膜，分別是細胞膜和囊泡膜。

現在，請你來告訴我，如何觀察到囊泡膜與細胞膜的融合過程呢？換句話講，如何觀察到細胞的胞吐過程呢？


  1. 觀察細胞膜的動態過程——實驗設置

將需要觀察的細胞放入一個小培養室中，這個細胞便處於一個三維的立體空間中，坐標軸可以分別用x，y，z來表示。用綠色螢光來標記細胞膜上的磷脂酶C，同時，在細胞外部放入紅色的染料。

實驗設置如下圖所示：

當我們在x，y組成的平面上觀察時，在細胞的中心觀察到的細胞膜是環狀的綠色；在細胞的底部觀察到的細胞膜則是一片綠。

如果在這裡你仍然能夠想像出這個底部和中心的話，說明你理解了這個實驗設置。那麼，我們接下來看實驗的結果。


  1. 細胞膜與囊泡膜的融合過程——全融合


細胞膜內層被綠色螢光標記：因為磷脂酶C在細胞膜內部呀，綠色螢光是連在磷脂酶C上的。

囊泡膜沒有螢光標記：因為囊泡膜上沒有磷脂酶C，所以囊泡膜沒有顏色。

那麼：

（1）當囊泡膜與細胞膜融合的瞬間，囊泡來不及變形。由於細胞膜的流動性，位於細胞膜上的螢光蛋白（PH-eGFP）會迅速移動到囊泡外層膜上。

超高解析度顯微鏡在x，z平面上觀察到的結果是：

起初平坦的細胞膜（綠色），在融合的瞬間，形成一個囊泡的形狀。

也就是說，細胞膜與囊泡膜融為一體的時候，磷脂酶C迅速流到了之前的囊泡膜上，所以融合的囊泡會瞬間變成綠色。


同時，細胞外部充滿了紅色的染料。

那麼：

（2）當囊泡膜與細胞膜融合的瞬間，如果兩層膜完全融合，囊泡內部與細胞外部即會連通。囊泡釋放出內部化學物質的同時，必然會導致外部的染料進入剛剛打開口的囊泡中。

超高解析度顯微鏡在x，z平面上觀察到的結果是：

起初位於細胞外部的染料（紅色），在融合的瞬間，進入到綠色的囊泡內部。

也就是說，胞吐的過程可以通過兩個方法觀察。一是用綠色螢光標記磷脂酶C，從而看到細胞膜內層與囊泡膜外層融合的過程。二是通過在細胞外部添加紅色染料，從而看到外部與囊泡內部連通起來的過程。


那麼，有沒有這樣的可能：細胞膜和囊泡膜只融合了一層，另一層沒有融合呢？


  1. 觀察半融合狀態

如果只融合了一層膜，那麼，細胞外部和囊泡內部是無法連通在一起的。

此時，超高解析度顯微鏡在x，z平面上觀察到的結果是：

起初平坦的細胞膜（綠色），在單層膜融合的情況下，仍然會出現一個囊泡的形狀。

然而，起初位於細胞外部的染料（紅色），在單層膜融合的情況下，不會進入綠色的囊泡內部。

也就是說，此時，儘管細胞膜和囊泡膜進行了融合，但是囊泡內部的物質並沒有吐出來。囊泡仍然保持封閉的狀態，因為它的內層膜並沒有和細胞膜發生融合。

這也使我們了解到在細胞外部加入紅色染料的必要性：

通過標記磷脂酶C，可以觀察到第一層膜有沒有融合。

通過紅色染料的變化，可以推測出第二層膜有沒有融合。

實際上，這種半融合狀態在囊泡融合過程中是廣泛存在的。並且，細胞能夠維持這種穩定的半融合狀態。（上圖中這種狀態就維持了十幾秒都沒變化）


那麼，再進一步，先融合第一層膜，再融合第二層膜的情況在細胞中同樣存在。

試想一下，如果是這種情況，此時，我們在超高解析度顯微鏡下會觀察到怎樣的過程呢？

我們下一篇文章繼續探討：。

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