【背景了解】
膽固醇是人類必需的脂質，是激素系統的構建單元，是類固醇激素的唯一前體，並參與多種維生素的合成。在血清中，高膽固醇水平與多種疾病有關，包括冠心病，心血管疾病，高血壓，心肌梗塞和癌症。但是，低膽固醇水平會導致低膽固醇血症，這可能會導致出血性中風。因此，開發一種簡便，廉價且可靠的血清樣品中膽固醇檢測方法非常重要。
迄今為止，已經提出了幾種方法來檢測膽固醇，例如電化學分析，基於螢光的測定，高效液相色譜法，分子印跡聚合物技術，化學發光和電產生的化學發光。這些策略中的一些顯示出高靈敏度和良好的選擇性。但是，它們通常需要昂貴的設備並且很費時間。比色法由於其快速和簡單的操作而引起了極大的興趣。此外，可以用肉眼觀察檢測結果，不需要昂貴的分析儀器。當前，基於納米材料的人造酶，例如Fe3O4納米顆粒，石墨烯納米球，金納米顆粒，MoS2納米片，CuO納米顆粒和金屬有機框架，由於它們的活性高，價格便宜且易於製備而受到廣泛關注。然而，許多金屬納米粒子聚集或呈現對固有性質的協同作用，從而導致活性降低。開發具有高催化活性和良好的長期儲存穩定性的納米酶對於解決這些缺點很重要。
聚吡咯納米顆粒（PPy NPs）是吡咯的一種有機導電聚合物，由於其高導電性，良好的熱穩定性和出色的生物相容性，在生物傳感和生化應用中引起了廣泛的關注。PPy NPs可以吸收近紅外光並將能量轉化為熱量，因此可以用作治療癌症的有效光熱療法。此外，PPy NPs通過電荷轉移機制可以用作有機螢光染料的強力猝滅劑。
【科研摘要】
湖南大學譚蔚泓院士團隊報告了一種通過耦合聚吡咯納米顆粒（PPy NPs）和膽固醇氧化酶（ChOx）的過氧化物酶樣活性來進行膽固醇檢測的簡便方法。ChOx可以催化膽固醇氧化生成H2O2。隨後，PPy NP作為一種納米酶，誘導H2O2與3,3'，5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）之間的反應（示意圖1A）。在最佳條件下，TMB在652 nm處的吸光度與膽固醇成正比，濃度為10至800μM。膽固醇的線性範圍為10–100μM，檢出限為3.5μM。該報導的方法成功地用於檢測人血清中的膽固醇。回收率範圍為96-106.9％。此外，作者使用提出的系統設計了一種簡便的可攜式測定試劑盒（無需儀器），實現了人血清中膽固醇的現場半定量和視覺檢測（示意圖1B）。從可攜式測定試劑盒中檢測到的膽固醇含量與基於溶液的測定獲得的膽固醇含量非常匹配，因此在臨床診斷和健康管理方面具有巨大潛力。
示意圖1.（A）使用PPy NPs作為過氧化物酶模擬物進行膽固醇檢測和（B）通過可攜式測定試劑盒對血清樣品中的膽固醇進行檢測的示意圖。
PPy NP的製備與表徵
PPy NP的形成機理如圖S1所示。簡而言之，吡咯單體在FeCl3的氧化溶液的存在下聚合。PPy NPs是通過Py的自由基陽離子形成而合成的，並使用PVP作為封端劑。透射電子顯微鏡（TEM）結果表明，所得PPy NPs（圖1A）是離散的，無定形的（插圖1A，插圖），均勻（平均直徑：40 nm）和分散良好（流體動力學直徑：約50 nm）。傅立葉變換紅外（FTIR）光譜（圖1B）顯示了PPy NP的峰，即3410 cm-1（NH拉伸振動），1650 cm-1（NH鍵變形），1561 cm-1（在吡咯環中拉伸振動C═C鍵），1465 cm-1（在環中C–N拉伸振動），1298 cm-1（CH鍵的面內振動），1214 cm-1（N–吡咯環的H彎曲拉伸模式），1048 cm-1（C–H和N–H鍵的面內拉伸振動）和928 cm-1（C–C鍵的拉伸振動）。PPy NP的紫外可見光譜在400-900 nm的波長範圍內顯示出較寬的吸收帶（圖1C），這表明摻雜的PPy處於雙極化金屬態。
圖1.（A）TEM圖像，高解析度TEM圖像（插圖）和選定區域的電子衍射（插圖）。（B）FTIR光譜。（C）PPy NP的紫外可見吸收光譜。（D）不同系統的紫外可見吸收光譜：（紅線）TMB + H2O2+ PPy NPs，（黑線）TMB + H2O2，（藍線）TMB + PPy NPs。插圖顯示了顯示顏色變化的數碼照片。
PPy NPs的過氧化物酶樣活性
通過在H2O2存在下催化TMB來檢測PPy NPs的過氧化物酶樣活性。如圖1D所示，與TMB + H2O2（黑線）或TMB + PPy NP（藍線）相比，TMB + H2O2+ PPy NPs（紅線）的吸光度得到了提高。這些結果表明PPy NPs固有的過氧化物酶樣活性。最佳的催化條件是通過改變pH，溫度和反應時間來進行的。由於具有最高的催化活性，因此選擇的pH為3.0，溫度為45°C。TMB + H2O2+ PPy NPs系統的吸光度隨時間增加，直到在30分鐘內達到平衡。因此，選擇30分鐘作為最佳反應時間。還評估了以TMB和H2O2為底物的PPy NPs的催化動力學機理。反應速率與底物（TMB和H2O2）濃度之間的關係可以使用Michaelis–Menten方程（等式1）進行模擬
1/V=(Km + [S])/(VmaxX [S])（1）
在這裡，V和Vmax代表初始和最大反應速度，Km代表米氏常數，[S]是底物濃度。根據該方程式，可以計算Km和Vmax並評估過氧化物的模擬酶活性。如圖2A，B所示，V隨著TMB或H2O2濃度的增加而增加，並且氧化反應遵循典型的Michaelis-Menten行為。PPy NPs對TMB（0.293 mM）和H2O2（0.184 mM）的計算Km值低於文獻中報導的納米酶的Km值。低Km揭示了酶對底物的高親和力。此外，TMB和H2O2的Vmax值與納米酶相當，這進一步證實了聚合物PPy NPs具有很高的過氧化物模擬酶活性。
圖2. PPy NPs對TMB（A）和H2O2（B）的穩態動力學測定。該值是使用NaAc-HAc緩衝液（0.2 M，pH 3.0）中的PPy NP（20μgmL-1）測量的。
膽固醇檢測
在檢測系統中，膽固醇的吸收強度保持不變，並且H2O2介導的TMB氧化幾乎不受膽固醇影響。通過優化ChOx催化膽固醇氧化的濃度和反應時間（圖S8），可以通過將ChOx與PPy NP催化氧化偶聯來實現膽固醇檢測。圖3A顯示了在不同膽固醇濃度下的相對吸光度。吸收強度隨膽固醇濃度（10–800μM）的增加而增加。當膽固醇濃度介於10和100μM之間時，在652 nm處的吸光度呈線性，相關方程A = 0.003C（膽固醇）+ 0.33（R2= 0.9984）（圖3B）。檢測限（LOD）估計為3.5μM（3σ/ k）。所建議的方法在10μM和100μM膽固醇下進行五次重複測定的相對標準偏差分別為1.53％和3.02％，證明了良好的重現性。
圖3.（A）不同濃度膽固醇的紫外可見吸收光譜。（B）吸光度峰值與膽固醇濃度的關係圖。插圖：圖的放大倍數在10–100μM範圍內。
方法的選擇性
此外，研究了血液中具有不同幹擾的膽固醇的濃度，例如尿酸，尿素，半胱氨酸，甘氨酸，MgCl2，穀氨酸，葡萄糖，抗壞血酸和多巴胺。如圖4所示，與尿酸，尿素，半胱氨酸，甘氨酸，MgCl2，穀氨酸，葡萄糖，抗壞血酸和多巴胺的幹擾相比，存在膽固醇（0.5 mM）時在652 nm處的吸光度顯著增加（2 毫米）。膽固醇與這些幹擾物質之間吸光度提高的差異具有統計學意義（p
圖4.該方法對膽固醇（500μM）和幹擾物質（2 mM）的特異性，包括尿酸，尿素，半胱氨酸，甘氨酸，MgCl2，穀氨酸，葡萄糖，抗壞血酸和多巴胺。
人血清中膽固醇的檢測
為了證明研究的分析可靠性，將人血清樣品用於測試。作者應用標準添加方法估算了五種不同血清樣品中的膽固醇水平。之後，將一系列膽固醇濃度（0、2、20和50μM）以等體積摻入血清樣品中，並測量膽固醇。如表S2所示，結果表明加標樣品的回收率良好，為96％至106.9％。血清樣品1和血清樣品2中的膽固醇濃度分別為4.21和3.50 mM。同時，使用建議的方法檢測到的膽固醇含量與使用ELISA試劑盒檢測到的膽固醇含量一致，這表明在實際應用中它可能是可行的（表S2）。使用相同的方法，其他三個血清樣品中的膽固醇濃度分別為3.08、5.30和4.86 mM。
表2.人血清中的總膽固醇檢測
此外，通過使用瓊脂糖水凝膠構建了一種簡單的可攜式測定試劑盒，以開發一種簡便的方法來進行血清中膽固醇的現場檢測（方案1B）。首先，確認可攜式測定試劑盒對幹擾物質表現出良好的選擇性（圖S9）。為了進一步研究可攜式測定試劑盒在實際樣品檢測中的適用性，進行了以下實驗。在瓊脂糖水凝膠形成過程中，將PPy NP，TMB，ChE和ChOx預加載到瓊脂糖水凝膠中，然後轉移到管帽中。將不同濃度（0.1–0.7 mM）的膽固醇移入試管中，並與瓊脂糖水凝膠一起孵育。如圖5A所示，隨著膽固醇濃度的增加，瓊脂糖水凝膠中的顏色從淺藍色變為深藍色可以用肉眼輕易辨別。此外，瓊脂糖水凝膠的顏色強度通過ImageJ軟體進行測量（圖5B）。顏色強度與膽固醇濃度的校準曲線在0.1 mM至0.7 mM範圍內幾乎呈線性關係。相應的線性方程為y = 0.32C（膽固醇）+ 2.03，相關係數為0.9954。與溶液測試相比，檢查了用於血清膽固醇檢測的可攜式測定試劑盒的可靠性。將10倍稀釋的血清樣品直接加入試管中，並與瓊脂糖水凝膠一起孵育。如圖5C（插圖）所示，五個不同的血清樣品在瓊脂糖水凝膠中顯示出不同的顏色。通過參考圖5B中相應的線性方程式，血清樣本1-5中的膽固醇濃度經計算為3.93、3.35、2.96、5.25和4.74 mM，對應於人類血清中的膽固醇水平，約為2.86-5.98 mM。此外，測定試劑盒獲得的結果與基於溶液測定的結果（R2= 0.9953）非常吻合（圖5C），表明定量評估人血清中膽固醇水平的可行性樣品。
圖5.（A）瓊脂糖水凝膠朝著不同濃度（從左至右：0–0.7 mM）的膽固醇標準的照片。（B）瓊脂糖水凝膠的顏色強度與不同膽固醇濃度的關係。（C）在人血清樣品中通過測定試劑盒測量的膽固醇濃度結果與基於溶液的測定法之間的相關性。插圖：瓊脂糖水凝膠對五個不同血清樣品的照片。
【陳述總結】
作者開發出一種簡單而靈敏的比色法，通過使用具有過氧化物酶樣活性的PPy NPs檢測血清中的膽固醇。通過與ChOx偶聯，膽固醇的線性動態範圍為0–100μM，LOD為3.5μM。此外，這種方法可以評估血清中的膽固醇水平，其結果與市售ELISA試劑盒的結果非常吻合。此外，構建了一種簡單，可攜式且無需儀器的測定試劑盒，用於檢測血清樣品中的膽固醇，為生物技術和臨床診斷中的應用提供了良好的平臺。
參見文獻：
doi.org/10.1021/acsami.0c15900
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