原創 高曉鵬 黃興琴 檢驗醫學網
作者：高曉鵬[1]、黃興琴[2]
單位：1.西安市兒童醫院中心實驗室
2.重慶市陸軍軍醫大學西南血液科實驗室
導讀
關於急性白血病，目前形態分類已經不是最終診斷，如果可以簡化到AML, APL, ALL 等大框框診斷，那麼APL（急性早幼粒細胞白血病）始終是診斷的重中之重，診斷必須快上加快，早一天診斷，早一天治療，結局完全不一樣，陰陽之隔一線間。堅守平日江蘇省人民醫院張建富老師對我們形態工作者病例教學的簡單和多次強化原則，關於APL我們從四大部分進行總結，包括：臨床表現、形態特徵、免疫分型、遺傳和分子生物學(MICM)。
APL臨床曲
APL四部曲（合集之一）
APL的發病率佔同期AML患者的10-15 %，在高齡患者中的佔比要低些。任何年齡均可發病，但大部分患者為中青年人，平均發病年齡為44歲，發病率約為0.23/10萬。為了強調融合基因PML-RARa的意義，WHO 2016分型將APL歸類為AML伴重現性遺傳學異常，WHO造血和淋巴組織腫瘤分類2017年修訂為APL伴PML-RARa。
01
APL除具有一般AML的共同臨床特徵即有發熱、貧血和出血外，APL臨床表現中出血（往往是較嚴重出血）是其特徵性表現，出血以皮膚黏膜為主，比如牙齦腫脹滲血、口腔黏膜血泡；其次為消化道、泌尿道、呼吸道、顱內出血，比如胃腸道出血、肺出血、非婦科疾病明顯的陰道出血，育齡女性可能會月經過多，致命的是中樞出血。APL肝脾淋巴結多數無腫大。但是初診時50%以上的病例無出血症狀，一旦出血進展迅速；起病及誘導治療過程中容易發生出血和栓塞而引起死亡。
出血、出血、出血
BLOOD、BLOOD、BLOOD！
重要的事情說三遍！
02
APL外周血常規絕大多數為三系減低，可高達80%，但也有約20%患者白細胞總數正常和增高等。以FAB分型的M3a多見白細胞減少，甚至全血細胞減少，貧血和血小板減少多為嚴重，主要原因是異常增殖的白血病細胞排擠了紅細胞和血小板的生成，血小板減少更為明顯；M3b和M3v多見白細胞增多，M3v （即微顆粒型 APL）白細胞數非常高，倍增時間快，並可伴有脾大。但是粗顆粒變異型APL可能外周血白細胞總數增高的。其實不管什麼病案，絕大多數都是臨床和診斷符合的，但是總有不按常理出牌的。APL散點圖可見異常早幼粒細胞瀰漫分布於單核/幼稚粒細胞群之間，呈淚滴狀散點圖。
03
有明顯的凝血障礙，凝血指標比如APTT、PT、Fg和DD二聚體異常，有低纖維蛋白血症，D-D二聚體增高等，提示有出血傾向，易發生DIC。APL一般都伴有比其他類型AML更加嚴重的出血症狀，出血因素與血小板減少固然有關，但最主要因素是異常早幼粒細胞胞質中顆粒釋放促凝物質和蛋白水解酶，引起DIC和纖溶亢進，發生廣泛而嚴重的出血，導致APL病情兇險。
04
高凝骨髓。病人往往有骨髓浸潤症狀(胸骨壓疼等)，提示醫生骨穿需要注意髓液有無很快出現高凝現象，往往剛剛從針管打在玻片上就發生凝集，呈現推不開的骨髓，必須快速製片，有經驗的老師可以快速推出3-5張片子，液片往往呈倒三角的稠密狀態，多數能推出兩三張骨髓液就凝集呈塊了，此時儘量蘸取周圍髓液多製片。操作時遇到這樣的情況要想到APL或者M5（出血或者脾大的往往也是兇險），儘快染色儘快鏡下看，迅速與臨床溝通告知形態學傾向，醫生可根據病情做出相關預處理治療，我們形態人的爭分奪秒就是幫助患者和死神賽跑！
05
APL藥物致病史。目前報導較多的是牛皮癬用乙雙嗎啉而導致的APL。臨床部分治療牛皮癬藥物比如：乙亞胺、雙酮嗪、乙雙嗎啉等藥物均可致染色體畸變，多在服藥2-7年中發生APL，上述藥物因致白血病作用已停產；肺癌患者使用吉非替尼藥物，可能也導致APL，在肺癌治療過程中的表皮細胞生長因子抑制劑與APL發病相關。APL絕大多數患者為原發性，據報導有10%左右APL是治療相關的，對於牛皮癬和肺癌患者的用藥史要問詢清楚。
06
APL治療用藥。APL被認為是通過藥物，不需要骨髓移植就可治癒的唯一的AML;目前多採用王振義院士和陳竺院士提出的上海方案，即以維A酸和三氧化二砷（As2O3）為基礎的雙誘導或輔以化療的三誘導方案治療。ATRA（全反式維甲酸）目的是推動異常早幼粒向成熟分化，讓早幼粒細胞不破損，防止細胞釋放的顆粒加速凝血功能障礙致嚴重出血，避免致命的出血併發症。砷劑的作用使得異常克隆轉為正常克隆，可使RARa轉陰。難治和復發患者對三氧化二砷反應良好，因此大部分患者可以長期存活，甚至治癒，但伴有CD56表達者預後相對較差！若查見異常早幼粒，懷疑患者APL，應作為危急值來報告臨床，而臨床醫生對疑為APL的患者，也常會立即使用全反式維甲酸，儘早給予ATRA治療是防治凝血功能異常最重要的因素，隨後根據融合基因的檢測結果調整用藥。對於高白APL單用ATRA誘導分化則會加重負荷，會更危險，應加ATO誘導細胞凋亡，進行雙誘導治療。2019NCCN指南指出，當首次懷疑APL時啟動ATRA治療，若細胞遺傳學和分子檢測不能證實APL則停用ATRA，按照AML方案治療。APL已成為基本不用進行造血幹細胞移植即可治癒的AML，並成為轉化醫學的典範。
APL形態曲
APL四部曲（合集之二）
APL的典型細胞具有四大特徵：
內外漿、不規則核形(蝶型核、臀樣核），柴捆棒子（Auer，S）、POX強陽性。
FAB將M3型分為3型：
M3a（胞質粗顆粒型）、M3b（胞質細顆粒型）、M3v（胞質微顆粒型，顆粒甚少或缺如，核型扭曲、分葉）。
（點擊圖片可放大）
WHO強調了重現性遺傳學遺傳的重要性，專門將APL伴PML-RARa列為一類。M3和APL不完全等同，前者以形態學為主，後者強調了融合基因PML-RARa。APL看異常早幼粒，強調的一定是異常兩字，即使正常早幼粒形態比例＞50%都不能診斷APL，在粒細胞缺乏症或者白血病化療過程中用了刺激因子後早幼粒細胞比例都可能明顯增高，胞體大顆粒粗且鬆散局部密集，核往往大而規則。假如是異常早幼粒細胞，胞體大小不一，倒三角或降落傘樣，胞質突起，核形變異，顆粒粗細不一，即使全片比例不足20%，也要提示臨床APL可能性大，建議結合染色體和融合基因檢查。
01
內外漿：異常早幼粒細胞大小不一，胞質豐富，可見內外胞質現象，胞質邊緣為外漿染藍色呈偽足樣突起，胞質內由於顆粒影響往往偏紅，內漿有的充滿密集的紫紅色嗜天青顆粒（粗顆粒），顆粒粗大深染密集融合常常遮蓋於核上；有的則為細顆粒或微小顆粒如灰塵樣肉眼不易見。紫紅色嗜天青顆粒（又稱聯苯胺藍顆粒）是促凝顆粒，引起DIC主要原因之一。M3v其早幼粒細胞高核質比，胞漿顆粒少或無，甲苯胺藍染色陽性。
02
不規則核形，也是異常早幼粒細胞的特徵性表現。常呈大小核、腎形、雙葉形、雙核、類臀樣、類蝴蝶樣、香梨樣、連體櫻桃樣等，似單核樣核；核染色質緻密，有的可見模糊核仁。個人體會M3a胞質粗顆粒多且積聚於一側，核形蝴蝶翅膀翩翩起舞樣，整個細胞猶如降落傘或花苞，M3b、M3v顆粒細小或無顆粒，核形不規則特徵突出，更象雙胞胎連體櫻桃或者車釐子模樣。其實不管形態像什麼，只要我們能根據個人經驗的積累識別出異常才是關鍵。
03
柴捆Auer
M3a易見單個和/或柴捆狀Auer，S小體，即柴捆（faggot）細胞，這是診斷急性早幼粒細胞白血病的有力證據；M3b可見或偶見Auer小體，M3v一般不見Auer小體，此亞型與M5細胞形態很難鑑別，但做了POX後很好鑑別，M3v呈強陽性，原幼單MPO多為弱陽性或陰性。再者幼單胞漿不像是內外漿現象，僅是有時偽足突起，漿染色不勻。柴捆狀Auer，S為多條細長的柴棒，束狀交叉排列，如同劍池，如同亂柴，有的細胞顆粒不典型，但是見到多條Auer小體者可幫助明確診斷。
04
細胞化學染色，異常早幼粒不論有無顆粒POX多呈強陽性反應，極個別可呈弱陽性或陰性，SBB和CE也多呈強陽性，往往在POX或者CE染色中可見胞漿針狀結晶，根據我們的經驗就是Auer小體。PAS異常早幼粒多為弱陽性反應，即胞質呈粉紅色。
形態診斷中的注意事項
01
外周血細胞形態分析，對於起病急且全血細胞減少的出血患者行外周血細胞形態分析時，應疑及APL。對白細胞低的必須全片瀏覽，要注意塗片的邊緣與尾部(即海岸線)的類單核樣細胞和/或典型的顆粒過多的早幼粒細胞，特別是破碎細胞胞質中易見奧爾小體，注意柴捆細胞。要閱片觀察，不僅僅分類，寧可錯殺，不可放過，並及時和臨床溝通。對於白細胞總數增高患者，細胞形態類似單核時要想到APL，此時要多部位觀察看有無柴捆細胞。（張建富老師多次病例講解強調的！很實用！）
02
骨髓象
多增生明顯活躍或極度活躍，紅、巨兩系受抑，異常早幼粒細胞佔比達85%以上，截頭去尾現象，原始粒細胞比例多<5%,即原始不能多，中後不能多。原始細胞增多可能是顆粒增多的M2或M4；中幼以後增多可能是伴病態的M2或AML-MRC。粗顆粒異常早幼粒細胞很好識別，但是細顆粒或微小顆粒的需要和M5和M2b鑑別，後兩者缺乏典型的粗顆粒早幼粒細胞以及典型的核形或柴捆小體,原始細胞比例往往>10%；APL往往一張片子裡粗細顆粒都可見，內外漿明顯。見柴捆細胞基本可以肯定為急性早幼粒細胞白血病，但是也不一定，也有報導不少AML可見柴捆Auer，S小體，但是並非APL；在APL病例中，也有類似包涵體樣物質，其本質是嗜天青顆粒融合形成的「圓奧」小體，此時要注意與其他類型白血病的鑑別，特別是M5。POX染色是較好的鑑別實驗，馬上行POX染色，強陽性者為M3，弱陽性或陰性者可能是M5；NBE染色M5陽性，APL陰性。
03
與急性嗜鹼性粒細胞白血病鑑別：嗜鹼顆粒少量、散在、粗大，覆蓋整個核，更易見成熟階段的嗜鹼性粒細胞。甲苯胺藍染色陽性。APL伴有嗜鹼性粒細胞增多的病例少見，臨床表現多見黏膜出血。
04
APL經過ATRA誘導分化治療後的複查骨髓像，見到較多的往下分化的下階段細胞，部分細胞可見內外漿，核扭曲、摺疊、雙分葉、蝴蝶形，下階段的中晚杆分均可見，胞漿中見單根和多根Auer，S小體，此為APL未緩解階段；有些細胞胞漿中顆粒減少，胞漿粉粉的，無較多嗜天青顆粒，這是APL在治療過程中的脫顆粒現象，與初診形態不一致。
APL免疫分型曲
APL四部曲（合集之三）
典型的APL免疫分型：
流式SSC大、幹細胞抗原CD34和HLA-DR不表達或低表達，CD117陽性，髓系分化抗原強表達MPO、CD33、CD15、CD13等，粒系分化標誌 CD15 和 CD65 為陰性或弱陽性，但常表達 CD64，共表達CD2和CD9。免疫表型不是APL確診的依據，分子學證據依靠FISH和RT-PCR。
在APL中，只有75％的病例存在CD34－HLA-DR－、CD117＋的表型，所以為了更有特異性的診斷APL，需要加入CD11b和CD11c這兩個粘附分子（CD11b－CD11c－），就可以形成一組對APL有100％特異性的指標。如果流式DR/34陰性，11b/c陽性，可理解為一定程度下往中幼階段分化了，腫瘤細胞發育並不能完全套正常細胞的發育模式，早晚標記會出現錯亂表達。少數形態學為微顆粒型或者少顆粒型或者PML-RARa融合基因為bcr3轉錄本的病例，SSC偏小，常表達CD2、CD34、HLA-DR（可部分表達），有的CD34和HLA—D R強表達，部分細胞還可表達CD11c，CD2在APL的表達通常與FLT3-ITD有關，FLT3-ITD突變最常見與高白、細顆粒型原始細胞形態和累及PML的bcr3斷裂點相關，而前述的免疫表型均缺失，此時分子學往往可發現S型PML-RARa。約 10% 的 APL伴CD56表達，往往提示預後差。
APL遺傳分子曲
APL四部曲（合集之四）
染色體檢查及分子生物檢查，診斷APL的金標準是RARa陽性。快速診斷可以用FISH方法和Q-PCR。染色體核型常見t（15；17）（q24；q12）和PML-RARa融合基因陽性。PML-RARa融合除了見於t(15;17)(q24.1;q21.2)易位外，還可以是隱蔽易位或複雜的細胞遺傳學重排導致，為了強調該融合基因PML-RARa的意義，WHO 2017分型中修訂為APL伴PML-RARa，該類白血病沒有強調染色體，僅強調基因陽性就能診斷。98%的APL患者存在PML/RARa融合基因，另有低於2%的APL患者為其他類型融合基因，精確的分子生物學診斷可為臨床選取治療方案提供依據。
01
常見t（15；17）（q24；q21）和PML/RARa約佔98.0%，PML/RARa對APL診斷具有特異性，也是治療的分子生物學基礎，所以WHO 2017分型中修訂為APL伴PML-RARa，就是提高了融合基因的地位。t（15；17）染色體易位，使17號染色體上的維甲酸受體RARa基因發生斷裂，與15號染色體上的早幼粒細胞白血病基因PML發生融合，形成PML/RARa融合基因，該基因的蛋白產物導致細胞分化阻滯和凋亡不足，是APL發生的主要分子機制。本型G帶形態特點為1條15號染色體長臂遠端出現深染帶，似乎有3條14號染色體，而17號染色體中的1條長臂均為陰性帶。從基因水平PML/RARa具有三種類型BCR1、BCR2、BCR3，也稱為長型（L）、變異型（V）和短型（S），BCR1型幼稚細胞為典型的多顆粒型，胞體大，胞漿豐富，可見內外漿及粗大顆粒，核形不規則，核染色質細緻，核仁可見，可見Auer小體，免疫表型為典型APL特點。BCR2型無明顯特殊性。BCR3型幼稚細胞常為微顆粒型，FCM可表現為SSC值比典型APL低，部分患者表達CD34，但多數患者免疫表型和BCR1型無明顯分別。本類型對全反式維甲酸敏感，生存期長。
（點擊圖片可放大）
02
還有APL伴變異型RARa易位，儘管WHO分類不算伴重現性遺傳學異常的AML，也是APL，涉及到隱匿異位、插入、複雜重排。2020版CSCO惡性血液病診療指南發布變異型APL近13種之多。
如：t（11；17）（q23；q12）和PLZF/RARa（鋅指基因），現在叫ZBTB16-RARa約佔0.8%，在WHO2017版則更新為APL伴變異型RARa易位（見WHO藍皮書P136）。臨床中十分少見，大約佔APL不到1%的比例，形態像多顆粒M2，形態學特徵即為異常細胞核形規則，顆粒多，常無Auer，S小體，Pelger樣的中性粒細胞增多，MPO強陽性，易誤診為多顆粒AML-M1/2，M2b。對維甲酸治療不敏感，單獨應用維甲酸誘導分化治療，療效欠佳，有報導採用維甲酸聯合化療、或亞砷酸聯合化療的方法可達CR，但長期效果欠佳。
03
t（5；17）(q35; q12)和NPM/RARa（5q35上核磷蛋白基因），初期的伴有t (5; 17)APL病例以多顆粒早幼粒細胞為主，有少數少顆粒早幼粒細胞，常無Auer，S小體，對全反式維甲酸有反應。
04
t（11；17）(q13; q21)和NUMA1/RARa（核基質相關基因）。對全反式維甲酸敏感。
05
der（17）dup（17）(q12; q12)和STAT5b/RARa，對全反式維甲酸無效。der（17）t（17；17）(q24; q12)PRKAR1a/RARa對全反式維甲酸有反應。
06
t（4；17）(q12; q21)和FIP1LI/RARa，少見類型。本型細胞胞質內外漿明顯，顆粒粗大，核形較規則類似被造血因子刺激後的早幼粒形態，顆粒更大似桑葚的表觀或者刺蝟模樣。對全反式維甲酸有反應。
07
t（X；17）(p11; q21)和BCOR/RARa對全反式維甲酸有反應。
08
t（7；17）(q11; q21)和GTF2I/RARa對全反式維甲酸無效。
09
t（1；17）(q42; q21)IRF2BP2/RARa對全反式維甲酸有反應。
10
還有t（2；17）(q32; q21)OBFC2A/RARa、t（3；17）(q26; q21)TBLR1/RARa、t（17；17）(q21; q21)STAT3/RARa、t（1；17）(q42; q21)FNDC3B/RARa等變異型。
11
極為罕見的i（17）（q10）類APL的AML，其形態學和M3a極為相似，但是染色體異常是由於17號染色體著絲點發生損傷或不合理的斷裂，導致其短臂缺失，長臂發生等臂而形成。. FISH檢測：nuc ish(PML×2，RARA×3)，PML/RARA易位探針未見融合信號，RARa（位於17q21）位點拷貝數增加。用全反式維甲酸及三氧化二砷無效，用AML方案強烈化療不佳，有報導單獨i（17）（q10）染色體異常療效差。該類型RARa拷貝增加的，形態學類似APL的，是否也是APL伴變異型RARa易位呢？還需收集病例進行分析研究。
12
部分病例可見繼發性細胞遺傳學異常，最常見的是+8染色體異常（10%～15%）和FLT3-ITD（34%～45% ）突變，包括內部串聯重複（ITD）和酪氨酸激酶域（TKD）突變。FLT3- ITD 突變最常見與較高的白細胞計數、低血小板有關，細顆粒型原始細胞形態和累及 PML 的bcr3 斷裂點相關。既往曾認為伴有FLT3-ITD基因突變的APL預後較差或容易復發，但2019年ELN研究提示：FLT3-ITD基因突變並不影響誘導治療效果及APL預後。
總結
APL的診斷能否及時準確發出，是細胞形態學工作者的重中之重，臨床特徵早診斷，早治療，是本型的特徵。牢抓APL形態學四個特徵：內外漿、不規則核形、柴捆棒子、POX強陽性，具備其中1-2個形態特點就需要考慮異常早幼粒細胞。確診APL的金標準是RARa融合基因陽性。除個別基因類型療效較差外，絕大多數患者可以長期存活，可以說是治癒。作為細胞形態學工作者，我們必須不斷修煉自己，積累細胞形態經驗，讓我們擁有一雙慧眼，讓患者受益。
特别致謝江蘇省人民醫院血液科實驗室張建富教授的點滴教導！致謝王海洋老師提供圖片。作者學識有限，難免有不足和錯誤之處，配圖為網絡搜圖或確診病例手機採集，清晰度不足，懇請專家和老師們提出批評指正！
原標題：《急急如律令，血拼急性早幼粒細胞白血病四部曲》
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