朱健康又攔不住了！在植物抗逆、表觀遺傳和基因編輯領域新進展

2020年1月至7月，來自中科院上海植物逆境生物學研究中心的朱健康團隊總共發表了28篇文章，現我們按照綜述、植物抗逆機制、表觀遺傳、基因編輯研究領域來系統的介紹一下相關的通訊文章：

綜述文章

01

Abscisic aciddynamics, signaling, and functions in plants.Chen K, Li GJ,Bressan RA, Song CP, Zhu JK, Zhao Y.J Integr Plant Biol. 2020 Jan;62(1):25-54. doi: 10.1111/jipb.12899. Review.

該綜述總結了近年來關於植物激素ABA的主要研究成果，重點討論了 ABA在代謝水平的動態調節、信號轉導以及對植物生理過程影響等方面的進展。

ABA在植物整個生命周期中多種生理過程的調控上扮演著重要的作用。這些過程包括種子成熟、葉發生、幹細胞維持、氣孔運動、光合作用、碳轉運、芽休眠、開花、果實成熟、源庫轉運、衰老等。ABA與受體PYR/PYL/RCARs結合，抑制PP2Cs活性，從而釋放SnRK2s蛋白激酶。SnRK2磷酸化激活轉錄因子ABFs和其他底物，從而在轉錄水平和翻譯後水平調控著這些重要的生理過程。

02

Plant abiotic stressresponse and nutrient use efficiency.

Gong Z, Xiong L,Shi H, Yang S, Herrera-Estrella LR, Xu G, Chao DY, Li J, Wang PY, Qin F, Li J,Ding Y, Shi Y, Wang Y, Yang Y, Guo Y, Zhu JK.Sci China Life Sci. 2020May;63(5):635-674. doi: 10.1007/s11427-020-1683-x. . Review.

綜述全文４０頁，3萬7千餘字，全面系統地總結了植物對逆境（包括乾旱、鹽脅迫、溫度脅迫、重金屬脅迫等）的感知與信號轉導的分子機制，以及植物在複雜的環境中利用養分的策略。

文章開篇總結了最近幾年在植物感知逆境信號領域的研究成果，並指出相比信號轉導下遊調控的分子機制，植物如何感知逆境信號依然是逆境信號研究的滯後環節。隨後，文章分別從乾旱、鹽、溫度、重金屬和養分利用五個方面展開論述，系統總結了植物響應上述逆境脅迫過程中信號轉導的分子機制、以及下遊調控的分子機制，具體包括：逆境響應基因激活的分子機制、細胞內離子平衡的分子機制、逆境下植物生長發育調節的分子機制等（詳見下圖模型）。

03

Epigenetic regulation in plant abiotic stress responses.Chang YN, Zhu C,Jiang J, Zhang H, Zhu JK, Duan CG.J Integr Plant Biol. 2020May;62(5):563-580. doi: 10.1111/jipb.12901. Review

表觀遺傳調控與非生物脅迫響應之間存在著密切而又非常複雜的關係。該文章總結了近些年來關於表觀遺傳調控參與非生物脅迫響應過程的研究進展，同時也指出了關於這兩個學科交叉領域研究的一些待解決的問題。動態變化的表觀修飾標記使脅迫響應基因的染色質區域處於活躍易表達狀態或者抑制表達狀態，進而在轉錄或轉錄後水平影響這些基因的表達。但是，逆境條件如何激活表觀機制對脅迫響應基因表達水平的重塑？表觀「信號」如何參與到植物的「逆境記憶」過程中並遺傳給後代？除了藉助於模式植物擬南芥，水稻等對相關機制的研究，其它糧食作物和經濟作物也可以作為研究對象，從而使人們對於這兩個學科進行更加全面的探索。

表觀遺傳途徑對植物極端溫度脅迫響應的調控
植物抗逆機制

04

Mutations in MIR396e and MIR396f increase grain size and modulate shoot architecture in rice.Miao C, Wang D,He R, Liu S, Zhu JK.Plant Biotechnol J. 2020 Feb;18(2):491-501. doi: 10.1111/pbi.13214.

理想的株型對作物產量至關重要，也是育種的一個重要目標。研究表明，miR396及其靶基因GRF（Growth-Regulating Factor）可以調控植物生長發育的各個方面。miR396還可以通過調節籽粒大小和穗部結構影響作物產量，同時，在番茄中的研究發現，miR396負調控果實大小。但是miR396在水稻生長中的確切作用和潛在機制尚不完全清楚。
該研究對水稻中的MIR396基因家族進行了基因編輯，發現MIR396e 和MIR396f 是籽粒大小和株型的兩個重要調節因子。mir396ef 突變引起籽粒變大，從而提高水稻產量。此外，mir396ef 突變還會影響水稻株型，導致葉片變長但節間縮短（尤其是最上部的節間）。進一步分析表明，mir396ef通過增加甲羥戊酸（mevalonic acid, MVA）及其合成產物赤黴素（gibberellin，GA）的水平來促進葉片伸長，但mir396ef突變體中的節間延長是由CYP96B4表達降低引起的，而不是通過GA途徑。該研究表明mir396ef突變可以影響籽粒大小和地上部株型，從而調控水稻產量。該研究為水稻優良品種的培育提供了候選基因。

mir396ef突變調節水稻地上部結構的作用模型

05

Lin Z, Li Y,Zhang Z, Liu X, Hsu CC, Du Y, Sang T, Zhu C, Wang Y, Satheesh V, Pratibha P,Zhao Y, Song CP, Tao WA, Zhu JK, Wang P. Nat Commun. 2020 Jan 30;11(1):613. doi:10.1038/s41467-020-14477-9.

乾旱、冷、高鹽等造成滲透脅迫，直接影響植物生長發育和作物的產量。相對於其它環境脅迫，由於缺乏有效的滲透脅迫特異的檢測標記，目前對於植物細胞滲透脅迫的感受和信號轉導途徑了解較少。目前已知蔗糖非發酵相關蛋白激酶2（SnRK2是植物滲透脅迫應答途徑的關鍵組分。模式植物擬南芥SnRK2家族有10個成員，其中9個能被滲透脅迫迅速激活。SnRK2的十突變體對滲A RAF-SnRK2 kinase cascade mediatesearly osmotic stress signaling in higher plants.透脅迫敏感。但滲透脅迫如何激活SnRK2尚不清楚。

　　該研究通過凝膠激酶分析發現除SnRK2外，另一組大分子量的蛋白激酶（100-130 kDa）也被滲透脅迫特異激活，並將其命名為滲透脅迫激活的蛋白激酶（osmotic stress activated protein kinases，OKs）。滲透脅迫處理2分鐘後OK即被迅速激活，且OK的激活不依賴於SnRK2。通過定量磷酸化組學研究，作者比較分析了野生型和SnRK2十突變體中滲透脅迫誘導的磷酸化變化。發現甘露醇處理後，RAF家族蛋白激酶的磷酸化迅速增加，且B亞組蛋白激酶的分子量與OK一致。通過CRISPR -Cas9，作者構建了RAF基因家族成員的多突變體。對突變體的檢測表明，B4亞組的7個成員特異地調控了ABA不依賴SnRK2（SnRK2.1/4/5/9/10）的激活，而B2和B3亞組的12個成員特異地調控了ABA依賴的SnRK2.2/3/6的激活。B4-RAF的多突變體對滲透脅迫超敏感。作者發現OK能直接與SnRK2相互作用並磷酸化SnRK2s。其中B4亞組RAF特異磷酸化SnRK2.1/4/5/9/10，而B2和B3亞組RAF特異磷酸化SnRK2.2/3/6。RAFs能磷酸化SnRK2蛋白激活環（activation loop）的多個位點。已知SnRK2.6蛋白S171和S175兩個保守的磷酸化位點對於SnRK2.6的激活是必須的。該研究證實了RAF家族蛋白激酶對於這一位點磷酸化，而不是SnRK2的自磷酸化（autophosphorylation）介導了滲透脅迫對SnRK2的激活。該研究還初步證實了RAFs家族蛋白激酶對於ABA誘導的SnRK2的激活也是必需的，B亞組RAFs的14突變體對ABA不敏感。

該研究揭示了RAF-SnRK2級聯途徑是滲透脅迫的早期信號途徑，為深入了解植物感受和應答滲透脅迫的分子機制提供了線索。同時，通過高通量磷酸蛋白組學鑑定未知蛋白激酶的探索和多基因家族的大規模敲除也為相關領域的研究提供參考。

06

The transcription factor ICE1 functions in cold stress response by binding to the promoters of CBF and COR genes.Tang K, Zhao L,Ren Y, Yang S, Zhu JK, Zhao C.J Integr Plant Biol. 2020 Mar;62(3):258-263. doi:10.1111/jipb.12918.

該文作者對The Plant Cell 論文的中一些數據進行了分析，結合前人的研究結果，以及作者的ChIP-Seq數據，確認ICE1轉錄因子直接參與調控低溫響應基因CBF以及部分COR（cold-responsive）基因的表達。

該評論文章指出，雖然PC文章作者在文中提到「在ice1-2 ice2-1雙突體中，低溫誘導的CBF 和COR 表達並未受到影響」，但實際上他們的數據清楚地表明，在ice1-2 ice2-1雙突材料中，低溫誘導的CBF3基因表達在低溫處理1小時後顯著地降低；低溫處理6，12和24小時後，低溫響應基因（如COR15A、RD29A、GolS3）的表達也明顯地下降。此外，之前多個獨立研究組均發現，CBF基因的表達在ice1單突變體中顯著下降 (Ding et al. 2015; Kim et al. 2015; Li et al. 2017)，並且ICE1在低溫響應中的作用已在水稻、玉米、番茄、黃瓜、梨等多個物種中有所報導。這些結果表明，ICE1確實參與調控CBF基因表達和植物低溫響應。
此外，作者利用全基因組ChIP-seq數據，進一步證實ICE1能夠直接結合到三個CBF基因的啟動子區域，並且發現ICE1能夠結合到多個低溫調控因子編碼基因（包括MPK4、HOS1、SFR2、CAMTA2等）的啟動子區域以及一些已知的COR基因（包括KIN2、RCI2A、RCI2B、COR413IM1等）的啟動子區域。這些結果表明，ICE1不僅直接參與調控CBF基因的表達，還參與調控其它低溫響應基因的表達。

ChIP-seq數據
最後，該文作者提出，ice1-1突變體並不是解析植物低溫脅迫響應的理想材料，因為有研究發現，ICE1 的突變（R236H）幹擾了與其負調控因子 MPK3 和 MPK6的互作 (Putarjunan et al. 2019)，也影響了ICE1的轉錄活性。同時，ICE1 和 ICE2 在功能上冗餘，而ice1-2 ice2-1雙突在土壤中不能成活。因此，未來需要創製合適的遺傳材料用於相關研究。作者也指出，今後的工作要確定ICE1如何與其它轉錄因子協同調控CBF基因的表達，以及ICE1與其它調控基因啟動子的結合如何影響ICE1在低溫響應中的功能。

07

Loss of salt tolerance during tomato domestication conferred by variation in a Na+ /K+ transporter.

Wang Z, Hong Y,Zhu G, Li Y, Niu Q, Yao J, Hua K, Bai J, Zhu Y, Shi H, Huang S, Zhu JK.EMBO J. 2020 May18;39(10):e103256. doi: 10.15252/embj.2019103256.

該研究發現，番茄馴化過程中番茄耐鹽性降低主要是由鈉鉀離子轉運體編碼基因SlHAK20中的自然變異導致的。

該研究中，研究人員測定了36個醋慄番茄品種，118個櫻桃番茄品種和215個大果番茄品種的根系和地上部分的鈉、鉀離子含量，發現根系中鈉鉀離子比在三個類群中依次顯著升高，根系內鈉鉀離子比與其抗鹽性負相關，但與番茄果實重量呈正相關。這表明，馴化過程中番茄耐鹽性降低很可能與果實大小選擇的馴化相關，即選擇果實大小的過程中與根系鈉鉀離子比增加相關的基因同時受到選擇，導致番茄抗鹽性降低。

通過對根系中鈉鉀離子比的全基因組關聯分析發現，位於四號染色體的最強關聯信號中包括HAK/KUP/KT鉀離子轉運體家族clade IV的成員，SlHAK20，其編碼區起始密碼子下遊48個鹼基位置上的自然變異位點indel48（6個鹼基對的插入/刪除）與番茄根中鈉鉀比高度關聯，與栽培種普遍存在的等位基因 (SlHAK20Hap2) 相比較，6個鹼基對插入變異 (SlHAK20Hap1) 主要存在於野生番茄中，利於其較強的耐鹽性。對該變異導致的SlHAK20功能差異分析發現，SlHAK20具有鉀、鈉離子轉運活性，而且SlHAK20Hap1對鈉離子的親和性顯著高於SlHAK20Hap2。

進一步的遺傳和離子含量分析表明，敲除野生或栽培品種中的SlHAK20都會造成番茄對鹽的敏感性增加，而在栽培品種中過表達SlHAK20Hap1可以顯著提高番茄的耐鹽能力，暗示番茄對鹽脅迫的響應是通過SlHAK20從木質部裝卸鈉離子來調節番茄中鈉鉀離子平衡實現的。該研究還發現，同時敲除水稻中SlHAK20的兩個同源基因OsHAK4和OsHAK17也會加劇水稻對鹽脅迫的敏感性，表明SlHAK20同源基因在單、雙子葉植物鹽脅迫應答反應中具有功能保守性。

綜上所述，該研究首次揭示了番茄馴化過程中耐鹽性狀丟失的分子遺傳機制，並為番茄和其它作物耐鹽性的遺傳改良提供了理論支持和重要的基因資源。

08

Natural variations in SlSOS1contribute to the loss of salt tolerance during tomato domestication.Wang Z, Hong Y,Li Y, Shi H, Yao J, Liu X, Wang F, Huang S, Zhu G, Zhu JK.Plant BiotechnolJ. 2020 Jul 7. doi: 10.1111/pbi.13443

前期對番茄耐鹽性研究中，朱健康課題組與中國農業科學院深圳農業基因組研究所黃三文課題組發現番茄的耐鹽性由野生到栽培的馴化過程中急劇降低，並鑑定了大量遺傳位點(Wang et al. 2020)。研究人員通過對326個番茄材料的遺傳分析，發現SlSOS1基因啟動子區的變異與群體根系中的鈉鉀離子比顯著關聯。啟動子上遊334和335處的兩個SNPs將群體材料分成鈉鉀比低（Hap1，CG）和鈉鉀比高（Hap2，TA）的兩類單倍型。Hap1主要存在於野生番茄中，其SlSOS1啟動子上存在一個CRT/DRE順式作用元件的核心序列CCGAC，在鹽脅迫下，誘導型轉錄因子DREB (dehydration-responsive element binding) 可結合SlSOS1的啟動子而啟動基因的表達，從而提高SOS1的表達水平促進植物對鹽脅迫的耐受能力。Hap2主要存在於栽培番茄群體中，TA的變異破壞了順式作用元件，使得轉錄因子無法結合，鹽脅迫的條件下，SlSOS1基因的表達明顯降低，耐鹽性狀也顯著減弱。為分析SlSOS1在番茄耐鹽性中的功能，該研究中利用基因編輯技術敲除SlSOS1基因，發現slsos1突變體與野生型相比對鹽脅迫超敏感。在鹽脅迫條件下，slsos1突變體根中的鈉鉀比顯著地高於其野生型，而該差異在鹽脅迫早期是由根系中鈉離子積累導致的，在長時間鹽脅迫時是由根系中鉀離子降低導致的。另外，長期鹽脅迫處理條件下，slsos1突變體較野生型地上部分的鈉離子含量顯著降低，這表明鹽脅迫條件下，SlSOS1能夠調節根和地上部分的鈉、鉀離子平衡。

該研究表明，栽培番茄抗鹽性在馴化中丟失的一個重要原因是SlSOS1啟動子變異，這種變異的使得SlDREB2等DREB家族轉錄因子失去結合SlSOS1啟動子的順式作用元件，造成SlSOS1表達量降低，導致番茄耐鹽性降低。

09

STCH4/REIL2 Confers Cold StressTolerance in Arabidopsis by Promoting rRNA Processing and CBF ProteinTranslation.Yu H, Kong X,Huang H, Wu W, Park J, Yun DJ, Lee BH, Shi H, Zhu JK.Cell Rep. 2020 Jan 7;30(1):229-242.e5.doi: 10.1016 / j.celrep.2019.12.012.
植物通過誘導某些特定轉錄因子的表達來響應低溫脅迫，而這些轉錄因子下遊的靶基因賦予了植物的耐凍性。作者篩選了擬南芥T-DNA插入突變體庫，鑑定了一個對於低溫超敏感的突變體，命名為stch4。STCH4/REIL2基因編碼一個核糖體生物發生因子，該基因在低溫脅迫時上調表達。過表達STCH4基因能夠賦予轉基因擬南芥植株較高的低溫和冰凍抗性。stch4突變降低了CBF蛋白的豐度，因此也延遲了C-重複序列結合因子CBF調節基因的誘導表達。核糖體RNA加工在stch4突變體中明顯減少，尤其是在低溫脅迫條件下。STCH4與多個核糖體蛋白相關，這些互作受到低溫脅迫的調控。本文的結果揭示了核糖體是擬南芥低溫脅迫響應的一個調控支點，STCH4通過促進核糖體組成的改變，在低溫條件下促進對植物生長和存活至關重要的蛋白的翻譯。

圖. STCH4作用機制模型

10

The plasma-membrane polyaminetransporter PUT3 is regulated by the Na+ /H+ antiporter SOS1 and protein kinase SOS2.Chai H, Guo J,Zhong Y, Hsu CC, Zou C, Wang P, Zhu JK, Shi H. New Phytol. 2020 May;226(3):785-797.doi: 10.1111/nph.16407.

該研究發現質膜蛋白PUT3和SOS1均可與蛋白激酶SOS2形成複合物,以應對脅迫條件,並通過蛋白相互作用和磷酸化調節彼此的轉運活性。

11

Reciprocal regulation betweennicotinamide adenine dinucleotide metabolism and abscisic acid and stressresponse pathways in Arabidopsis.Hong Y, Wang Z,Shi H, Yao J, Liu X, Wang F, Zeng L, Xie Z, Zhu JK. PLoS Genet. 2020 Jun 22;16(6):e1008892.doi: 10.1371/journal.pgen.1008892.

首次揭示擬南芥NAD代謝途徑與ABA信號通路之間相互調節在植物應答非生物脅迫中的作用。
該研究中，研究人員利用擬南芥T-DNA插入缺失突變體庫進行正向遺傳篩選得到冷脅迫敏感突變體htc1（hypersensitive to chilling 1），但進一步的遺傳互補實驗表明其冷敏感表型並不是T-DNA的插入所導致。利用圖位克隆和基因組重測序結合的方法，研究人員發現導致htc1冷敏感表型的突變是編碼NAD從頭合成關鍵酶喹啉酸合成酶（quinolinate synthase, QS）基因上的鹼基替換導致其編碼蛋白第288位穀氨醯胺突變為穀氨酸（Q288E），造成NAD從頭合成通路被破壞，因而分離掉T-DNA插入的突變體命名為qs-2。該突變導致NAD及其代謝物含量明顯降低而打破了NAD在植物體內的穩態平衡，嚴重影響qs-2對多種非生物脅迫應答，包括對鹽脅迫和外源ABA處理敏感，對乾旱脅迫耐受等，表明NAD的穩態在植物應答非生物脅迫中發揮重要作用。
對其ABA處理敏感的分子機理進行進一步的研究發現，qs-2的ABA敏感表型和活性氧（ROS）過度積累表型能被編碼ABA信號通路核心組分蛋白激酶SnRK2s（SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6）或下遊的NADPH氧化酶RBOHF的基因缺失所回復，而該表型與ABA合成沒有明顯關聯，表明NAD的穩態參與ABA信號通路誘導的ROS積累對非生物脅迫應答的調節。此外，ABA下遊轉錄因子ABI4能夠特異結合QS基因啟動子上的CE1元件，抑制其在外源ABA誘導下的轉錄水平上調，從而形成ABA信號對NAD合成途徑的反饋調節。

圖 SnRK2s的缺失能夠回復qs-2對ABA敏感的表型。
綜上所述，該項研究首次提出了一個NAD代謝與ABA信號通路在植物生長和應答非生物脅迫中相互調節的工作模型，為作物改良中協調植物生長和脅迫應答之間的平衡提供重要的理論基礎。

12

CDK8 is associated with RAP2.6 and SnRK2.6 and positively modulates abscisic acid signaling and drought responsein Arabidopsis.Zhu Y, Huang P,Guo P, Chong L, Yu G, Sun X, Hu T, Li Y, Hsu CC, Tang K, Zhou Y, Zhao C, Gao W,Tao WA, Mengiste T, Zhu JK.New Phytol. 2020 Jul 3. doi: 10.1111/nph.16787.

本研究結果揭示了CDK8在ABA信號與RNA聚合酶II中的連接性作用，為CDK8在調控ABA信號和乾旱響應中的作用提供了新的見解。

中介體複合物(Mediator Complex)是一個大型的多蛋白複合體，是保守的真核轉錄機器的基本組成部分，其中CDK8是中介體複合物的一個關鍵亞基。然而，CDK8在植物非生物脅迫響應中的生物學功能還沒有得到較多的研究。

本文證明了在擬南芥中，CDK8是ABA信號和乾旱響應途徑中一個關鍵的調節因子。與野生型相比，cdk8突變體表現出對ABA的敏感性降低，氣孔開度受損，以及對乾旱脅迫的超敏感。轉錄組和染色質免疫沉澱分析表明，CDK8可能通過促進RNA聚合酶II向一些ABA響應基因啟動子的募集來正調控這些基因的轉錄。

研究發現CDK8和SnRK2.6都與ERF/AP2轉錄因子RAP2.6有物理上的相互作用，RAP2.6能與RD29A和COR15A的啟動子的GCC或DRE元件直接結合，從而促進它們的表達。重要的是，研究還發現CDK8在ABA誘導的RAP2.6的表達以及RAP2.6介導的ABA響應基因的上調中是必不可少的，這表明CDK8可以將SnRK2.6介導的ABA信號與RNA聚合酶II連接起來，促進對ABA和乾旱信號的即時轉錄反應。

基因編輯技術

13

Targeted, efficient sequenceinsertion and replacement in rice.Lu Y, Tian Y,Shen R, Yao Q, Wang M, Chen M, Dong J, Zhang T, Li F, Lei M, Zhu JK.Nat Biotechnol. 2020 Jul 6. doi: 10.1038/s41587-020-0581-5. Online ahead of print

該研究採用修飾後的DNA片段作為供體，在水稻上建立了一種高效的片段靶向敲入和替換技術，高至50%的靶向敲入效率將極大地方便植物的研究和育種。

近年來，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點編輯技術在農作物基因功能研究和精準育種中發揮了重要作用，展現了廣闊的發展潛力和應用前景。然而，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點敲除技術只能在基因組特定位點產生隨機插入和刪除，精準的片段插入和替換的效率一直很低，極大地限制了其在植物研究和育種上的應用。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組片段插入和替換技術體系。 植物基因組編輯是朱健康實驗室的重點研究領域，他們在近幾年來獲得了一系列的進展。作為該領域的重大難題，片段的靶向敲入和替換一直是他們的一個重要研究目標，也一直在圍繞這一目標努力。在成功地建立了病毒介導的同源重組（HDR）和各類單鹼基編輯技術等多種方法的同時，他們也開始嘗試在供體DNA片段上尋找突破點，以克服現有方法效率低、應用範圍窄等缺陷。核酸修飾在人的RNAi療法和核酸疫苗等醫學領域有廣泛的應用。

該研究通過嘗試，發現將供體片段同時進行硫代修飾和磷酸化修飾後，能極大地增強CRISPR/Cas9引導的靶向敲入效率(見下圖)。

之後，該研究先後在14個基因位點上成功靶向敲入了各類調控元件，包括翻譯增強子、轉錄調控元件，甚至整個啟動子，供體片段最長達2049bp。通過對1393株各類T0代基因編輯水稻植株的分析發現，該方法的敲入效率可高達47.3%，平均效率為25%（見下表）。高效的敲入效率甚至可以同時在四個位點上實現多基因靶向敲入。可以預計，該技術的建立將使靶向敲入成為一項和靶向敲除一樣的常規實驗，被各個植物研究和育種單位廣泛應用。

在此基礎上，該研究又巧妙地設計了一種片段精準替換的策略，稱之為重複片段介導的同源重組（TR-HDR）方法。常規的HDR頻率極其低下，但他們在前期的實驗中發現，基因組上串聯重複片段間的HDR頻率非常高。他們利用該現象，通過將修飾的片段靶向敲入至目標位點後，人為製造這種串聯重複結構，誘導TR-HDR去實現片段替換。

該研究採用該技術，在五個基因位點上實現了片段替換和原位的Flag標籤蛋白的精準融合，效率最高達到了11.4%（見下圖）。這一技術突破將非常有助於植物學研究，並大大促進農作物定向遺傳改良的進程。

14

Simplified adenine base editorsimprove adenine base editing efficiency in rice.Hua K, Tao X,Liang W, Zhang Z, Gou R, Zhu JK. Plant Biotechnol J. 2020 Mar;18(3):770-778. doi:10.1111/pbi.13244.

腺嘌呤單鹼基編輯器（ABE）可以將植物基因組的A鹼基修改為G鹼基。然而，現有的腺嘌呤單鹼基編輯器的編輯效率仍然不高。最近，中科院上海植物逆境生物學研究中心朱健康團隊發現，用於大腸桿菌中的ABE結構能顯著提高腺嘌呤單鹼基編輯器在水稻中的編輯效率。

用於大腸桿菌和用於哺乳動物中的ABE系統是不同的，哺乳動物中的ABE系統多了一個ecTadA蛋白。然而，研究人員發現，相比於廣泛使用的腺嘌呤單鹼基編輯器ABE-P1（含ecTadA-ecTadA*7.10-nSpCas9（D10A）結構），用於大腸桿菌中的簡化版腺嘌呤單鹼基編輯器ABE-P1S（含ecTadA*7.10-nSpCas9（D10A）結構）在水稻中的編輯效率更高。而且ABE-P1S在水稻愈傷和原生質體中的蛋白表達量也比ABE-P1要高，這可能也是其編輯效率更高的原因。

此外，ecTadA*7.10-nCas9融合蛋白也可以用來改良其他ABE系統的編輯效率，例如包含SaCas9或SaKKH-Cas9變體的ABE，從而拓寬單鹼基編輯的範圍。

15

Precision genome engineering in riceusing prime editing system.Hua K, Jiang Y,Tao X, Zhu JK.Plant BiotechnolJ. 2020 May 6. doi: 10.1111/pbi.13395.

prime editing，它可以將人為插入或刪除的序列引入目標位點，而不需要雙鏈斷裂（DSBs）。2019年David Liu發表的動物中使用的prime editing體系包含一種Moloney小鼠白血病病毒逆轉錄酶（M-MLV RT），融合到SpCas9（H840A）nickase的C端，這種融合蛋白由一個引導RNA（pegRNA）引導到靶位點，除了指定靶位點外，pegRNA還包含一個引物結合位點（PBS），該位點與用於反轉錄的PAM鏈和模板序列（即RT序列）互補，將引入靶位點的遺傳信息編碼在RT序列中。

首先團隊創建了Sp-PE2，Sp-PE3和Sa-PE3的編輯體系，與Sp-PE2相比，Sp-PE3可以表達額外的nick-sgRNA在 Sa-PE3體系中，SaCas9是一種多重周轉酶，比SpCas9更快地釋放裂解的DNA產物，用SaCas9（N580A）替換的Sp-Pes中SpCas9（H840A），因為它有助於逆轉錄酶進行反轉錄可能會提高編輯效率。

然後先驗證這三個體系在水稻中是否會發生編輯，構建CaM35S啟動的Y67和G68都變成終止密碼子的EGFP表達盒，只有兩個精確的鹼基轉換（T-G和G-C）才能恢復野生型EGFP序列，而indels或其他形式的鹼基轉換則不能。利用農桿菌介導的方法將T-DNA載體導入水稻愈傷組織中，結果表明Sp-PE2超過50%的愈傷組織表現出GFP信號，而Sa-PE3編輯效率最低。

最後驗證Sp-Pes是否能使水稻內源基因發生編輯效應，對ALS基因定點鹼基編輯（G-A），結果表明Sp-PE3可以實現精確的鹼基轉化，但不同位點的轉化效率不同。但目前prime editing在植物中編輯效率很低這是期待解決的問題。

16

Gene targeting in Arabidopsis via anall-in-one strategy that uses a translational enhancer to aid Cas9 expression.Peng F, Zhang W,Zeng W, Zhu JK, Miki D. Plant Biotechnol J. 2020 Apr;18(4):892-894. doi:10.1111/pbi.13265.

實現了一步到位（all-in-one）的基因打靶方法。在該研究中，將Cas9蛋白、gRNA和HR修復供體序列一次性全部設計在同一個載體上進行一次轉化（如下圖所示）。此外，該研究還增加源於TMV的Ω翻譯增強子序列以增強Cas9蛋白的表達，在HR供體序列兩側增加sgRNA識別位點及使用具有EC1.1啟動子的嵌合EC1.2 / DD45增強子來驅動Cas9表達。該研究發現，在不使用增強子等元件的條件下，基因敲入的效率只有0.68%。而通過利用源於TMV的Ω翻譯增強子序列增強Cas9蛋白的表達，在DD45啟動子的驅動下，能將基因敲入的效率提高3倍，達到2.4%。此外，研究發現，EC1.2/DD45的增強子配合EC1.1啟動Cas9蛋白的表達，在該體系中並沒有效果。在HR供體序列兩側增加sgRNA識別位點，也不能增加基因敲入的效率。

該研究表明，儘管使用all-in-one策略進行基因打靶的效率低於兩步法的效率，但是在未來的工作中，將進一步優化all-in-one策略，提高基因打靶的效率，使其能更高效地應用於擬南芥的任一生態型或者基因組背景植株，或其他能使用浸花法轉化的高等植物。
表觀遺傳機制

17

Epigenetic memory marks determineepiallele stability at loci targeted by de novo DNA methylation.Li J, Yang DL,Huang H, Zhang G, He L, Pang J, Lozano-Durán R, Lang Z, Zhu JK. Nat Plants. 2020Jun;6(6):661-674. doi: 10.1038/s41477-020-0671-

該研究首次發現DNA從頭甲基化的改變也能穩定遺傳的現象，並闡明了DNA甲基化和組蛋白修飾等多種表觀遺傳修飾機制共同決定了從頭甲基化通路—RdDM依賴的表觀等位基因的形成分子機制。該研究揭示了從頭（de novo）DNA甲基化穩定遺傳的機制，為深入了解表觀等位基因的形成及穩定遺傳提供了線索。

RNA聚合酶Pol IV負責產生的24-nt siRNA是RdDM途徑的關鍵一環。該研究通過分析模式植物擬南芥Pol IV最大亞基NRPD1敲除突變體轉基因互補株系的DNA甲基化恢復情況，將RdDM靶位點分為兩類：甲基化丟失後可以恢復的CD位點和不能恢復的ND位點。生物信息學分析表明CD和ND位點的多種遺傳及表觀遺傳特徵是不同的。相較於CD位點，ND位點富含較高水平的活性染色質標記，如組蛋白H3K4me3修飾和H3K18ac修飾；另一方面，不同於ND位點在nrpd1突變體中幾乎丟失了所有序列類型的DNA甲基化，CD位點在突變體中依然保留了部分CG以及CHG甲基化。這些特徵可能導致了它們在DNA甲基化丟失後恢復過程中的不同表現。研究人員通過敲除組蛋白H3K4甲基轉移酶將部分ND位點轉變為CD位點，證明ND位點處較高水平的H3K4me3修飾會阻礙RdDM組分的招募。此外，敲除DNA去甲基化酶ROS1後也會導致部分ND位點轉變為CD位點，表明較高水平的H3K18ac修飾可能通過招募DNA去甲基化酶到ND位點進行去甲基化，進而阻礙RdDM通路在此處建立DNA甲基化。研究人員進一步利用CRISPR/dCas9-TET1cd表觀基因組定點編輯系統對nrpd1突變體中特定CD位點保留的mCG和mCHG進行定向去甲基化，之後即使恢復NRPD1基因的正常功能，也不能在這些位點從頭起始DNA甲基化，證明了CD位點在nrpd1突變體中保留的CG和CHG甲基化可以作為記憶標記招募RdDM組分。

18

DNA demethylases are required formyo-inositol-mediated mutualism between plants and beneficial rhizobacteria.Vílchez JI, YangY, He D, Zi H, Peng L, Lv S, Kaushal R, Wang W, Huang W, Liu R, Lang Z, Miki D,Tang K, Paré PW, Song CP, Zhu JK, Zhang H.Nat Plants. 2020 Jul 13. doi: 10.1038/s41477-020-0707

DNA主動去甲基控制YC4和番茄之間的肌醇介導的共生關係，且該機制具有保守性。

根系相關的土壤細菌對植物的適應性有很大的影響。DNA甲基化是一個表觀遺傳標記，對許多基本的生物學過程很重要；然而，它在植物與有益微生物的相互作用中所扮演的角色仍然是不明確的。本文報導了擬南芥中依賴於ROS1的活性DNA去甲基化確保了巨芽孢桿菌菌株YC4在擬南芥根上的有效定殖，從而促進了植物的生長。活躍的DNA去甲基化控制了根中肌醇的分泌，從而促進了巨芽孢桿菌菌株YC4的植物生長。根分泌的肌醇對YC4定殖是至關重要的，並優先吸引被檢測的細菌種類中的大菌群。活躍的DNA去甲基化控制著肌醇介導的YC4和番茄之間的互惠作用，表明這種表觀遺傳調控機制的保守性。

綜上所述，該研究不僅發現了控制植物-PGPR相互作用的新型植物化學信息素，而且還表明這種相互作用受DNA甲基化的表觀遺傳控制。因此，該研究為後續研究開闢了新途徑，將促進對控制根分泌和微生物組組分的表觀遺傳機制的進一步研究。