1、原理
如圖,
符號代表CRISPR/CAS9結合位點,
其上黑色豎線代表雙鏈DNA切割位置。
GOI為待插入片段:Gene of intrest
原理名HITI——(homology-independent targeted integration):
此方法的關鍵在於donor(提供插入序列的載體)的結構,
即,在GOI至少一端引入與待修飾基因相同的CAS9靶位點,
圖中用了3種形式:1cut、2cut、minicircle。
CAS9質粒+donor共同轉染細胞後,CAS9介導基因組和donor質粒在靶位點斷裂(DSB),
此時,最大概率並高效率發生的是donor片段以確定方向填補到基因組DSB處(紅框標記),
因為反方向會被CAS9再次識別切割回爐(右上角黑色箭頭)。
2、特點
● 基因編輯效率高
1) 基於HDR(同源臂介導,不懂百度)的基因編輯:
Donor:tGFP(含左右同源臂)
OR
2) 基於HITI的基因編輯:
Donor:IRESmCherry-1c/2c/MC(Minicircle). c means,cut.
3) 基於HITI+HDR的基因編輯:
Donor:IRESmCherry-HDR-2c, c means,cut.
4) 對照:
Donor:IRESmCherry-MC-scramble, IRESmCherry-HDR-0c. c means ,cut.
基因編輯效率對比如下:
基因編輯效率:
HITI(40%左右)>HITI+HDR(10%左右)>HDR(2%左右)
且HITI保真性較高,引入突變(Indel)的概率較小。
這個很重要,
哺乳動物體內大多數細胞為非分裂細胞,
對這些細胞基因編輯後可直接影響表型。
使用HITI方法,小鼠中基因編輯比例為肺(4.2%),心臟(3.4%),肌肉(10%),
當然,不論醫療還是科研,編輯效率最好再提高些。
具有細胞感染譜廣,安全性高,感染效率高的特點。
通過尾靜脈注射2個AAV
一個表達CAS9,一個表達sgRNA及待插入序列,
就可實現如上圖的編輯效果。
OK,既然理論基礎有了——
那麼,以上這些型,
你選哪一個?
In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 2016 Nov 16. doi: 10.1038/nature20565. [Epub ahead of print]
長按加關注