復仇者聯盟前傳之變身黎明 ——非分裂細胞的在體基因編輯

2021-02-12 吉凱基因轉化醫學平臺

1、原理


如圖,
符號代表CRISPR/CAS9結合位點,

其上黑色豎線代表雙鏈DNA切割位置。

GOI為待插入片段:Gene of intrest

原理名HITI——(homology-independent targeted integration):

此方法的關鍵在於donor(提供插入序列的載體)的結構,

即,在GOI至少一端引入與待修飾基因相同的CAS9靶位點,

圖中用了3種形式:1cut、2cut、minicircle。

CAS9質粒+donor共同轉染細胞後,CAS9介導基因組和donor質粒在靶位點斷裂(DSB),

此時,最大概率並高效率發生的是donor片段以確定方向填補到基因組DSB處(紅框標記)

因為反方向會被CAS9再次識別切割回爐(右上角黑色箭頭)

2、特點

  基因編輯效率高 

1)  基於HDR(同源臂介導,不懂百度)的基因編輯:

Donor:tGFP(含左右同源臂)


OR



2)  基於HITI的基因編輯:

Donor:IRESmCherry-1c/2c/MC(Minicircle). c means,cut.



3)  基於HITI+HDR的基因編輯:

Donor:IRESmCherry-HDR-2c, c means,cut.



4)  對照:

Donor:IRESmCherry-MC-scramble, IRESmCherry-HDR-0c. c means ,cut.



基因編輯效率對比如下:


基因編輯效率:

HITI(40%左右)>HITI+HDR(10%左右)>HDR(2%左右)

且HITI保真性較高,引入突變(Indel)的概率較小。

這個很重要,

哺乳動物體內大多數細胞為非分裂細胞,

對這些細胞基因編輯後可直接影響表型。


使用HITI方法,小鼠中基因編輯比例為肺(4.2%),心臟(3.4%),肌肉(10%),

當然,不論醫療還是科研,編輯效率最好再提高些。

具有細胞感染譜廣,安全性高,感染效率高的特點。

通過尾靜脈注射2個AAV

一個表達CAS9,一個表達sgRNA及待插入序列,

就可實現如上圖的編輯效果。

OK,既然理論基礎有了——



那麼,以上這些型,

你選哪一個?

In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 2016 Nov 16. doi: 10.1038/nature20565. [Epub ahead of print]


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