腫瘤具有高死亡率、高轉移率和高復發率，是危害人類健康的重大疾病。診斷腫瘤的傳統方法有病理組織活檢、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、電子計算機斷層掃描(computed tomography，CT)、B超、X線胸片、內鏡檢查等。這些檢查對於腫瘤早期的檢測效果十分有限，部分檢測方法不僅價格昂貴，且會給患者帶來痛苦。因此，在腫瘤早期階段開展快速、有效的檢測十分必要，不僅可以達到早發現、早治療的目的，還可以改善患者就醫體驗。腫瘤標誌物的篩檢對於腫瘤早期檢測具有重要意義[1]。
腫瘤標誌物是指由腫瘤組織或宿主與腫瘤相互作用所產生的一類活性物質，能夠提示腫瘤存在與生長變化。腫瘤標誌物常常存在於血清、細胞、尿液、體液或組織中，常見的有癌胚蛋白、腫瘤抗原、酶類標誌物、激素、糖類抗原等。腫瘤標誌物檢測具有操作便捷、標本易獲取、非侵入性、價格低廉、易於動態監測疾病等優點。腫瘤標誌物的檢測對於腫瘤的預防、早期診斷與鑑別診斷、輔助腫瘤分類、疾病監測、指導治療和預後判斷有重要作用，可有效彌補其他醫學技術對腫瘤診斷、治療及預後判斷的不足[2]。腫瘤標誌物種類繁多，檢測方法也各異，本文將幾種常見腫瘤標誌物檢測方法的研究進展作一綜述。
1、放射免疫分析
放射免疫分析是一種傳統的檢測腫瘤標誌物的方法，是將放射性核素檢測技術與抗原抗體結合特異性的特點相結合，以定量微量物質。放射免疫分析多使用放射性核素125I，因其具有放射性高、易標記、衰變過程中釋放的射線易於被檢測等優勢，逐漸替代了3H和14C而被廣泛使用。放射性核素標記具有高靈敏度、易於商品化等優勢，曾被廣泛應用，但與其他方法[3]相比，存在試劑盒使用壽命短、有放射性汙染風險等缺點，目前已逐漸被其他檢測方法取代。
2、化學發光免疫分析
化學發光免疫分析是目前常用和較為成熟的腫瘤標誌物檢測技術，其利用化學發光物質作為標記物，根據發光信號的強度來判斷待測物質的量。自1928年德國化學家Albrecht發現魯米諾的化學發光特性後，該檢測技術由於靈敏度高、快速、線性範圍廣、儀器結構簡單、適合小型化、無放射性危害等優點得到不斷發展[4，5]。化學發光免疫分析為化學發光法，使用直接發光物質(如吖啶酯)標記抗體，或使用酶類催化劑(如辣根過氧化物酶)[6]標記抗原抗體。將化學發光技術與微晶片電泳化學發光(microchip-electrophoresis chemiluminescence，MCE-CL)等技術聯合使用，具有效率高、分析快、自動化程度高、需要更少樣品和試劑的優點[7，8]。
傳統化學免疫分析採用酶標技術，用辣根過氧化物酶催化魯米諾的免疫測定技術曾被廣泛使用，目前的免疫測定系統通常使用信號探針標記抗體並進一步測量目標分析物濃度。但這類天然酶具有穩定性差、來源有限、對環境變化敏感、易受環境影響而變性等缺點，且標記過程通常會損害抗體分子的生物活性，因而基於金屬及金屬複合物[9，10]、磁性納米顆粒[11]、量子點[12]等催化發光底物的無酶免疫系統[13]不斷發展，將電化學技術和化學發光相結合檢測腫瘤標誌物，兼具了化學發光的高靈敏度和電化學的時間、空間可控性[14，15]的優點。有研究人員以CuS納米粒子作為過氧化物酶模擬物，設計了一種新型的無標記化學發光(chemiluminescence，CL)免疫方法測定甲胎蛋白，與基於酶標的CL免疫測定法相比，提出的無標記測定模式更簡單、價廉、快速。採用無標記的CL免疫測定法測定甲胎蛋白的線性範圍為0.1~60ng/mL，檢出限為0.07 ng/mL，且此CL免疫測定系統顯示出良好的特異性、可接受的重複性和良好的準確性[16]。
3、酶聯免疫吸附試驗
酶聯免疫吸附試驗是一項臨床上已普及的檢測技術，這一技術將抗原或抗體包被於固相支持物上，將酶標抗原或抗體加入抗原抗體複合物中，通過底物使酶顯色來達到檢測目的。不同的研究人員會採用不同的酶聯免疫吸附試驗策略，如使用單克隆多克隆抗體[17]及嵌合抗體[18]來開發腫瘤標誌物檢測試劑盒。酶聯免疫吸附試驗被開發後其檢測系統得到不同的優化，如凝集素及生物素-親和素系統[19]在酶聯免疫吸附試驗中的應用大大增強了其檢測的敏感性，螢光素酶夾心酶聯免疫吸附試驗系統[20]也使檢測的敏感性不斷增強。酶聯免疫吸附試驗不僅適用於對單一分析物的測定，在多個分析物同時存在時，同樣具有良好的適用性[21]。
除酶聯免疫吸附試驗外，越來越多的研究集中於開發具有酶樣活性的模擬酶[22]。ZHANG等[23]以Cu2+作為助催化劑，利用Cu2+/Ag-AgI複合物作為催化劑具有在可見光下使3，3´，5，5´-四甲基聯苯胺(3，3´，5，5´-tetramethylbenzidine，TMB)顏色產生變化的特性，構建了夾心型比色法，通過監測TMB溶液的顏色變化以定量癌胚抗原的水平，其開發的比色免疫測定在血清樣品分析中表現出良好的選擇性、重複性和穩定性。
4、免疫傳感器
免疫傳感器一直備受腫瘤研究者關注和青睞。將特異性免疫反應與生物傳感技術相結合形成的生物傳感器，其生物識別部分來自抗原與抗體的特異性識別和結合作用，通過理化換能器和信號放大裝置將生物信號轉變為電信號用於檢測。與其他幾種檢測方法相比，免疫傳感器具有靈敏度高、操作方便、設備簡單、成本低、可實現實時動態檢測等優勢。目前，免疫傳感器大部分處於試驗階段，正向高通量、商品化發展，以滿足臨床大樣本檢測的要求，隨著技術的不斷成熟，有望成為腫瘤標誌物的新型檢測手段。檢驗醫學網
金屬納米材料由於擁有獨特的光學、電子和催化特性常被用於構建免疫傳感器[24，25]。LIU等[26]使用多孔鉑納米顆粒和PdPt納米籠同時測定腫瘤標誌物癌胚抗原和甲胎蛋白，利用多孔鉑納米顆粒較大的表面積和較強的導電性，PdPt納米籠優異的催化性能及高負載能力，增強和放大響應信號，實現了對雙重分析物的靈敏測定。另外，使用納米合金材料製作的傳感器，與使用單一金屬材料相比具有更好的生物相容性，金屬之間良好的協同作用使傳感器催化性能進一步被放大。ZHANG等[27]使用PdPt納米顆粒，以石墨烯片和多壁碳納米管作為傳感平臺，組成納米複合物修飾電極，來測定腫瘤標誌物潛伏膜蛋白-1，比單獨使用Pd納米粒子具有更高的過氧化物酶活性，PdPt凹面不僅可以提供較大的表面積，還可以提供更豐富的催化反應活性位點。
碳納米材料，包括單壁碳納米管、多壁碳納米管、石墨烯、碳納米纖維、碳球等，由於其良好的力學性能、較高的化學穩定性、特殊的電學性質、優異的機械性能和良好的導熱性被廣泛用於免疫傳感器的製造，製造的傳感器具有響應速度快、電子傳遞速率高、負載量大、吸附性好、催化活性等優點。LIANG等[28]研製了以雙層酶修飾碳納米管作為標記的夾心型免疫傳感器，利用層層自組裝技術將辣根過氧化物酶裝配到多壁碳納米管上，實現了信號放大，為臨床分析的超靈敏檢測提供了有力的支持。
聚合物複合材料由於良好的氧化還原性能，被作為免疫傳感器信號指示劑[29，30]。TANG等[31]用聚多巴胺-PB2+(PDA-Pb2+)納米複合材料作為氧化還原體系，用殼聚糖-金納米複合材料塗覆電極，對癌胚抗原進行敏感性的電流分析。利用聚合物複合材料製作的免疫傳感器，因聚合物複合材料摻雜帶來的半導體或導體性質，其活性可被調節，摻雜/去摻雜的可逆過程使其可檢測不同的分析對象，擴大了檢測範圍。
免疫傳感器的製備除上述幾種材料外，還常引入其他具有不同功能的材料來提高性能。如利用量子點高表面活性、小尺寸及對光、電、溫度等敏感的特性，構建的傳感器靈敏度較高[32，33];利用磁性納米粒子的磁效應構建的傳感器抗幹擾性好[34];利用介孔材料良好的孔隙結構和界面結構構建的傳感器，能夠保持酶良好的活性和功能性;利用水凝膠構建的傳感器穩定性好，水溶性高，能夠對外界刺激產生響應並產生相應變化[35]。此外，利用羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)納米顆粒，利用HAP-NPs與鉬酸鹽的反應檢測甲胎蛋白，構建的傳感器選擇性好、靈敏度高，且成本低[36]。
5、蛋白組學
蛋白組學是近年來興起的腫瘤研究領域熱點之一，以蛋白質為核心，對蛋白質的表達模式和功能模式進行研究。蛋白組學技術具有高通量、微型化、自動化的優勢，目前被廣泛用於臨床腫瘤學研究，為腫瘤標誌物的研究提供了良好的平臺，但同時具有檢測成本昂貴、對技術人員操作要求高等缺點。
①雙向電泳
雙向電泳是蛋白組學的經典技術，是利用蛋白質的等電點和不同相對分子質量來分離蛋白質的一門技術。雙向電泳是蛋白組學的核心技術之一，能夠通過染色強度得到蛋白質翻譯後修飾的信息，能夠同時分離數千種蛋白質。但其有不能分辨低拷貝數蛋白、檢測蛋白比估計總蛋白數少、耗時長、操作過程繁瑣等缺點，不能實現完全自動化，研究者常將其與質譜技術聯用以分離、鑑定蛋白質[37]，即將蛋白質用雙向電泳分離後，運用質譜技術進行逐一鑑定，這也成為蛋白組學研究的核心技術。相差凝膠電泳在雙向電泳的基礎上利用不同的染色對2個樣本進行標記，通量更高，提高了凝膠間的可比性，工作效率得到提升。
②質譜技術
質譜技術是將物質離子化，根據不同質荷比進行時間和空間的分離，進而獲得樣品的相對分子質量、分子結構等多種信息的分析方法。由於其具有高分辨力、高精度等特點被廣泛用於多個領域。近年來，常用色譜-質譜技術，因其兼具了色譜的分離能力和質譜的鑑定能力，能夠對蛋白質進行準確、快速的分析和定量[39，40]。基質輔助雷射解吸飛行時間質譜和電噴霧電離質譜是經過改進的質譜技術，前者利用基質吸收雷射的能量，得到肽質量指紋譜，通過檢索資料庫以鑑定蛋白質;後者利用電噴霧法，液相化多肽以鑑定蛋白質。這2種方法能保證電離時樣品分子的完整性，不會使離子碎片化。檢驗醫學網
③蛋白質晶片
蛋白質晶片是近十年來新興的分析技術，即在支持物表面排列蛋白質探針以捕獲目標蛋白，再通過檢測器進行定性或定量分析。根據載體性質不同，可分為固相蛋白質晶片和液相蛋白質晶片，臨床上常用來篩選和尋找腫瘤標誌物。反相蛋白質晶片也是蛋白組學高通量方法[41]。蛋白質晶片不僅可用來研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用，還可研究蛋白質與核苷酸間的相互作用，具有通量高、速度快、靈敏度高的優點。DUAN等[42]設計了一種蛋白質晶片，使用膠體納米金標記葡萄球菌屬蛋白A作為指標，應用免疫金銀染色增強技術擴增檢測信號，此蛋白質晶片可在不存在交叉反應的情況下檢測B型肝炎病毒抗體和C型肝炎病毒抗體，並可在40min內提供結果，速度相對酶聯免疫吸附試驗等方法更快。YANG等[43]開發了一種微陣列晶片，首次使用矽和水凝膠作為微陣列的載體，構成的晶片具有二氧化矽和水凝膠兩者的優點。
④表面增強雷射解析及電離飛行時間質譜
表面增強雷射解析及電離飛行時間質譜是將質譜與蛋白質分離技術相結合的技術，能夠檢測到其他傳統方法檢測不到的蛋白質，只需少量樣品，檢測時間短且重複性高，可分析複雜樣品。該技術基於特殊晶片的表明增強吸附作用，將樣品蛋白質吸附到晶片上後，將結合蛋白質解離成核電離子以繪製質譜圖。將健康人與腫瘤患者的蛋白圖譜進行比較，能夠發現差異表達的蛋白質。JIN等[44]開發了一種對糖類抗原19-9正常的胰腺癌患者與健康或良性個體進行診斷和鑑別診斷的方法，使用與CM10晶片聯合的表面增強雷射解吸及電離飛行時間質譜分析相關樣品，生成了具有不同蛋白質的診斷模型。
6、分子生物學方法
檢測腫瘤標誌物的分子生物學方法包括聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction，PCR)、螢光原位雜交技術(fluorescencein situ hybridization， FISH)、逆轉錄PCR、單鏈構象多態性(single-strand conformationpolymorphism，SSCP)、多種測序技術等。分子生物學技術具有高通量，特異性強、敏感性高等優勢，但也存在價格昂貴、檢測周期長等缺點。
PCR是目前被廣泛使用的一種簡單、敏感、高效、特異和快速的，能在體外擴增DNA的技術。由經典PCR衍生出的技術被廣泛應用於腫瘤標誌物的檢測，如逆轉錄PCR被用於口咽癌[45]、結直腸癌[46]、前列腺癌[47]、肺癌[48]等多種腫瘤的檢測。甲基化特異性PCR是一種檢測特異位點甲基化的技術[49]，檢測DNA甲基化敏感性極高，KOIKE等[50]發現甲基化特異性PCR對於胃癌標誌物的檢出率高於逆轉錄PCR。此外，多種PCR衍生技術如擴增融合PCR、實時螢光定量PCR等也被運用於腫瘤標誌物的檢測。
FISH以標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，根據核酸鹼基配對原理，將標記的探針與單鏈核酸片段配對，在螢光顯微鏡下觀察目標序列的分布。FISH雖屬於低通量檢測，但目前已被用於檢測腫瘤細胞[51]、突變染色體[52]、染色體重排[53]，在腫瘤生物標誌物檢測和個體化醫療方面具有重要意義。
7、液體活檢
液體活檢是一種從血液等非實性樣本中取樣，用於診斷和檢測腫瘤的方法。液體活檢技術主要包括循環腫瘤細胞(circulating tumor cell， CTC)檢測、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)檢測、外泌體檢測等。與組織活檢相比，液體活檢能夠早期篩查、檢測腫瘤標誌物，克服了腫瘤的時空異質性，具有無創、易反覆取樣、操作簡便、可實時監控等優點，但同時也有價格昂貴、檢測標準不統一等缺點。CTC檢測目前主要使用的是免疫細胞化學方法，但CTC極低的豐度及其異質性使其面臨著技術挑戰。ctDNA檢測主要採用分子生物學方法，但ct DNA具有易降解、含量低等缺點，為精準檢測帶來困難。外泌體檢測在腫瘤診斷方面顯示出良好的應用前景，是具有發展潛力的診斷方法，但其提取及操作尚無統一流程，檢測系統有待進一步完善，以滿足臨床大規模樣本檢測的需要。檢驗醫學網
總結
腫瘤標誌物作為臨床上腫瘤輔助診斷、治療參考以及預後判斷的重要指標，目前在應用上愈發廣泛，臨床對檢測技術的要求也不斷發展。不僅有大量靈敏度或特異性更高的標誌物被發現，而且在檢測方法上也緊跟臨床工作需求而不斷發展。不同檢測方法均有其優勢與不足，如何對不同方法進行整合，提高腫瘤標誌物的檢出能力，是研究者們需關注和探索的問題。能夠在腫瘤早期檢出低含量腫瘤標誌物，永遠是臨床腫瘤診斷的主要需求。不管使用何種材料，使用何種方法，提高檢測的敏感性和特異性及穩定性永遠是腫瘤標誌物研發所追求的目標。
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