厭氧氨氧化40年回顧 | 關於耐心和傳承的故事

在1986年之前，人們都不相信有可在厭氧環境下「氧化」氨氮的細菌。一個荷蘭生物工程師和一個微生物教授的偶遇改變了一切。到了1999年7月，這位微生物學家連同其他幾位學者，在《Nature》雜誌上宣布了一個重大發現：「厭氧氨氧化」菌屬於浮黴菌門。在日後關於anammox的文章裡，這個人的名字會被反覆引用。他的名字叫Gijs Kuenen。

如果你不知道Gijs Kuenen是誰的話，那說明你對厭氧氨氧化的歷史還知之甚少。如果說誰最有資格為厭氧氨氧化作傳的話，也非Gijs Kuenen教授莫屬。幸運的是，Kuenen教授最近還真的將過去40年厭氧氨氧化史好好地梳理了一遍，並發表在2020年第二期的《Environmental Microbiology》上，題為《Anammox and Beyond》。我已經寫過好多篇關於厭氧氨氧化的文章了，估計國內沒有人比我積累更多的素材了，借Kuenen教授這篇綜述，我覺得可以為大家好好整理一下關於厭氧氨氧化的那些事兒。

從硫細菌說起

1940年12月9日，Gijs Kuenen出生於阿姆斯特丹西邊的小城Heemstede。1972年，Kuenen教授在格羅寧根大學獲得微生物學博士學位。畢業後他在洛杉磯和格羅寧根輾轉了幾年，隨後在1980年到代爾夫特，成為TU Delft第四任的微生物教授。前三人都是代爾夫特理工的傳奇人物，包括Martinus Beijerinck、Albert Kluyver和Cornelis van Niel。

Kuenen教授說，每次回想，都讓他愈發感覺微生物界各種人和事之間奇妙的聯繫。他說關於anammox的故事可以從他在格羅寧根大學讀本科的時候說起。當時這門課的授課老師叫Hans Veldkamp教授(1923-2002)，Veldkamp的導師則是Albert Kluyer (圈子的傳承)。在為期六周的微生物課裡，他學會了如何對多種微生物和代謝類型進行富集培養，而這種方法正是TU Delft首任微生物教授Martinus Beijerinck發明的。後來Veldkamp教授則成為了Kuenen教授博士學位的導師。他的博士論文是關於兩種硫氧化菌(SOB)的比較。在此後很長的一段時間裡，他的研究都是圍繞SOB展開的。在1980年他回到Delft之後，他開始尋求SOB在工業上的應用。巧合的是，當時荷蘭瓦赫寧根大學的Gatze Lettinga教授正在研究汙水的厭氧處理技術。兩位教授聯合本地的一家叫Paques的小公司，成功地開發了生物脫硫工藝，去除汙水中的硫化氫，並回收單質硫。Paques公司後來也將這項工藝技術商業化，取名THIOPAQ。取名者正是Kuenen和Lettinga聯合培養的博士生Cees Buisman，後來他也成為了瓦大環境系的教授。關於硫細菌更多的八卦故事，大家可以回看我在國際水協會寫過的文章《生物脫硫技術的前世今生》。

在大學當教授之餘，當時Kuenen每周會抽幾小時給給一家叫Gist-Brocades (GB)的生物公司當諮詢顧問的。1987年，GB公司請他為公司一套新的廢水厭氧處理系統的硫循環做技術指導。這套系統本來是要用來解決工廠產生的臭氣問題的。但在此期間，GB公司的運行人員卻發現系統中一個奇怪現象——中試運行數月後，反硝化反應池的氨氮濃度下降了，硝酸鹽也減少了，還有明顯的氮氣產出。「書裡不是說氨氮只能在好氧條件才會轉化嗎？反硝化池的氨氮濃度應該保持不變才對啊？」時任GB公司研究員的Arnold Mulder對此十分不解。他通過領導找到了 Kuenen教授進行諮詢。

1984年的Gist Brocades 青黴素製藥廠 | 圖源: ANP

Mulder先生的發現喚起了Kuenen教授塵封了10年的記憶，他告訴Mulder：「我10年前就看過一篇paper報導過這個現象。」 Kuenen教授指的是1977年67歲的奧地利理論化學家Engelbert Broda寫的題為「Two kinds of lithotrophs missing in Nature（德語原題Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie）」的文章。此文在當時學術圈可謂一聲驚雷。當時37歲的Kuenen也拜讀了這篇文章，並和同事們展開討論，但他們大都認為氨是不可能在厭氧條件下被氧化的…

兩人開始了進一步的研究。很有商業意識的Arnold很快給這個潛在工藝起了一個朗朗上口的名字——ANAMMOX（厭氧氨氧化）。然而，他們初期的嘗試並不算成功：他無法通過傳統的培養富集法提取出這個反應發生的微生物，因此無法確定這是一個自發的化學反應，還是一個生物反應。

Kuenen此時又想起了奧地利人Broda的文章裡列出的兩條熱力學方程式：

Kuenen教授提議用15-N同位素示蹤技術來確認氮氣是否來自氨氮，並將此重任交給了他的一位女碩士生——Astrid van de Graaf。Astrid在實驗室用流化床反應器做實驗，成功發現了14,15-N2。這個發現固然讓人激動萬分，但他們還需要更多的證據來充分印證這個反應的生物屬性。幸運的是，Kuenen教授向荷蘭技術基金會（STW）申請到資金為Astrid專門開設一個博士項目，確保後者可以安心將研究進行下去。

在證明生物反應的存在後，Astrid接下來要繼續用15-N示蹤標記法識別各種中間物和最終產物，並嘗試富集反應的微生物。別的不說，考慮到anammox菌超慢的生長速率(約0.001-0.002/h)，Astrid的工作量只能通過省略一萬字來處理。她的勇氣也值得欽佩。幸好皇天不負有心人，在一次偶然的嘗試中，他們發現anammox反應的基質是亞硝酸鹽，而不是硝酸鹽，而且部分亞硝酸鹽會轉化成硝態氮用於固定二氧化碳。

第一個20年

我認為，Kuenen教授在1980年入職TU Delft後的20年可以算是厭氧氨氧化的第一個20年。這個階段以驗證anammox為焦點，在熱力學方程式為指導，最終通過富集培養、流化床反應器、同位素示蹤標記等手段證明了anammox的存在，並描繪了基本的代謝路徑。

Astrid在完成她的博士學位後，並沒有選擇繼續anammox的研究，1994年，在Delft當了6年研究員之後，她去了荷蘭科學中心NEMO做科普內容去了（荷蘭人真的很有個性）。Kuenen教授將下一個挑戰交給了Marc Strous博士，讓他對anammox菌進行富集提純。利用SBR反應器，Marc成功地可重複地培養高產量的anammox菌，純度提高至70％。

有了高純度的微生物，Kuenen教授的團隊可以做更多分析了。他找到澳洲昆士蘭大學的John Fuerst教授幫忙確認目標微生物。藉助電子顯微鏡的近距離觀察，他們發現這些細胞有一個奇怪的、靠膜隔開的內室。這可是一個大驚喜！要知道，只有更複雜(真核)細胞才有這種隔室，就像人類細胞擁有的細胞器（organelles）。他們將這個東西取名厭氧氨氧化體(anammoxosome)。這些細胞器負責執行特定的生物學功能，對細胞組分、代謝過程和信號傳導途徑起時空控制作用。簡單的原核細胞和細菌都沒有細胞器。目前科學家只知道浮黴菌（Planctomycetes）具有這種結構，因此研究團隊推斷anammox菌屬於該門。

anammox細胞的透射電子顯微鏡照片和截面手繪圖(比例尺0.2μm)

話說浮黴菌非常奇特，因為它同時含有細菌、真菌和古菌三大菌屬的特性，因此有些人認為該菌在早期可能跟三大菌屬是同一個祖先。只是DNA的研究將它們歸在了細菌數一類。可以說，浮黴菌的出現模糊了細菌的定義。在此之前，沒有人將浮黴菌門跟厭氧氨氧化拉上關係，但Kuenen教授的團隊用氨氮和亞硝態氮培養出了這種細胞，底物也隨反應過程消失。這也從側面說明anammox菌的特別之處。

這個說個題外話：他們將這個第一次測序分析的anammox菌取名Candidatus Brocadia anammoxidans：anammoxidans表示其獨特的生化特性，Brocadia既表示了這些細菌的發現地(Brocades)，另外也因為這些鮮紅色的細菌讓研究者聯想到明豔的織錦。

第二個20年

「21世紀是生物的世紀。」這句話雖然更多拿來被揶揄，但在我看來，到本世紀再來看，可能就成真知了。就以anammox為例，在2000-2020年之間，關於它的許多新發現都有賴於生物技術的進步。

16S rRNA基因測序的普及幫助科學家對更多的anammox菌進行命名。例如Mike Jetten和Michael Wagner就說服法國基因測序中心Genoscope幫Kuenen團隊在一個流化床反應器的富集物進行DNA，並找出了新的菌種，並以Kuenen的姓命名(Candidatus Kuenenia stuttgartiensis)。測序結果也顯示基因組相當大(4.27 Mb)，還含有大量細胞色素基因，這也解釋了anammox菌呈紅色的原因。

這也開啟了anammox菌的宏基因組分析的時代。隨著DNA測序技術的發展，Kuenenia菌的基因組由Mike Jetten教授帶領的團隊得到進一步完善。Jetten團隊開展大量的生物化學和酶學研究，在anammox的代謝路徑方面取得了重大突破。例如通過結構分析發現anammoxosome是能量轉化的場所，又例如發現一氧化氮才是許多anammox菌的反應中間物(而不是羥胺)。

Jetten團隊總結的anammoxosome的能量代謝流程圖

可以說，21世紀以來，厭氧氨氧化研究已經遍及各個方面，從基因組學、蛋白組學、環境和生態微生物學。 值得一提的是，雖然實驗和分析手段在過去20多年有了很大改進，不過時至今日，科學家依然無法得到純種的anammox細菌，這也是為什麼這些菌目前都以Candidatus命名。Kuenen表示希望他的學生以及學生的學生們可以早日得到單菌株，這樣就可以摘掉Candidatus的前綴。

沒有終點的探索

之前我們提到Mulder先生早在上世紀80年代末就為Anammox工藝註冊了專利。但因為anammox菌超慢的生長速率，那個年代的人對anammox技術的前景並不看好，壓根沒有公司感興趣！唯獨Mark van Loosdrecht教授叫他的學生Udo van Dongen試著去搭一個兩段式的反應系統，第一段將部分氨氮氧化成亞硝態氮，第二段是厭氧氨氧化流化床。實驗結果成功打動了鹿特丹的Dokhaven汙水廠。後者和TU Delft合作進行中試實驗，處理厭氧消化池的高濃度氨氮出水。最後的結果如今大家都知道了——側流厭氧氨氧化工藝已經成為很成熟的工藝，但你可能不知道的是，Kuenen教授和Van Loosdrecht教授當時可是花了2年多時間的穩定運行才打動鹿特丹市所屬的水委會。

Kuenen教授在這篇12頁的綜述裡，將學術界和工程界在1977到2020年裡對厭氧氨氧化認知的變化都寫了一遍。這是一個關於時間和耐心的故事。43年，說長不長，說短不短。但對於1972年博士畢業、2005年退休的Gijs Kuenen教授來說，厭氧氨氧化幾乎貫穿了他的科研生涯。雖然硫氧化菌才是Kuenen教授的摯愛，但最後讓他流芳百世的卻是厭氧氨氧化菌(anammox第二個屬Kuenenia就以他命名)。

Kuenen教授在文章最後說道：「對作者而言，這個故事就到此為止了，但欣慰的是，微生物學的奇妙旅程仍將繼續。」這是一個沒有終點的探索。相信在下一個20年，厭氧氨氧化的研究還有很多驚喜值得期待。

參考資料

1.https://academic.oup.com/femsec/article/44/1/1/502430

2.https://zhuanlan.zhihu.com/p/32308326

3.https://www.c2w.nl/over-ons/astrid-van-de-graaf/item18343

4.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17021940

5.https://search.proquest.com/openview/8a4e1fe2ace1d146d63fff55397d4ebd/1.pdf?pq-origsite=gscholar&cbl=54134

6.https://mp.weixin.qq.com/s/s-XsZkMJdQiKCPnAAiRsOg