基因幹擾技術哪家強？CRISPRi與RNAi對比大揭秘

2020-11-09 海星生物

基因功能研究，尤其是在細胞系的基因功能研究，通常是從三板斧開始的——基因幹擾、基因過表達、基因敲除。

三板斧揮出去，配合下遊的轉錄譜分析、表型分析，基因功能的神秘面紗，往往就能解開一角。

如果表型不明顯，文章不好發，基金不好寫，那麼找個的關聯基因，來一套組合三板斧，往往就能解決問題。沒什麼是三板斧解決不了的，一套不行，那就再來一套。

基因幹擾，作為三板斧的開路先鋒，因為價格實惠、操作簡單，而備受青睞。從化學合成RNA，到病毒包裝shRNA，再到CRISPR-dCas9介導的CRISPRi，以及Cas13a介導的mRNA水平的敲除，各種基因幹擾技術紛雜繁複，那麼哪種技術更勝一籌，哪種技術更合文章審稿人和專家的口味？基因幹擾應該怎麼做？

目前，基因幹擾方面應用最廣泛最成熟的還是短髮卡RNA（shRNA）介導的RNAi技術。過去十幾年，RNAi一直是基因功能研究尤其是功能基因組學篩選的首選方法。但是CRISPR技術的橫空出世，憑藉著更低的脫靶效率，更高的幹擾水平，尤其是乘著今年諾貝爾化學獎的東風，勢必會衝擊RNAi的王座，成為審稿人和專家眼中的新寵兒。

那麼，CRISPRi與RNAi究竟有什麼不同，在做方案設計或者基金申報撰寫時，CRISPRi好在哪裡？

CRISPRi技術基於一個沒有核酸酶活性的dCas9蛋白，即通過將RuvC和NHN兩個核酸酶結構域分別導入胺基酸突變D10A和H840A，使得Cas9蛋白失去切割DNA活性，但仍保留結合DNA的能力（Dead Cas9）。

圖1. dCas9結構域

當dCas9被引導到某個基因的轉錄起始位點TSS（transcription start site）時，dCas9能夠物理性阻礙RNA聚合酶的通過，導致基因沉默。為了進一步提高轉錄抑制的效率，dCas9融合了一個基因抑制結構域，如KRAB（krüppel-associated box）結構域，此外，dCas9也可以融合雙抑制結構域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。

圖2. CRISPRi工作原理

因此通常，CRISPRi擁有比RNAi更高的幹擾效率和更低的脫靶風險，在基因幹擾能力上顯著優於傳統的RNAi技術。

Yi Zheng et al.CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivationin the brain.Nature Nueroscience. 2018


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