聚焦張辰宇「miRNA重大發現」後的國際研究動態

2020-12-05 中國生物技術信息網

2012年, 南京大學張辰宇教授及其團隊在Cell Research雜誌(22(1),2012)上發表了一篇有關小RNA(miRNA)的論文(為敘述方便,以下簡稱「張文」), 該文在國內外相關領域引起重視。

「張文」的要點是:口服植物食品,植物中的小RNA可以進入動物和人體內, 並能調節肝臟的生理功能。如果這能被確證,則在國際上就是一個重大的發現:植物的小RNA可以通過口服,從植物食品轉移到動物,並調控動物基因的表達,即miRNA在植物界和動物界之間可以實現「跨界基因調控」(cross-kingdom gene regulation)。它暗示是否可用此途徑來研製口服RNA新藥,治療或控制某些重要疾病。即使沒有普遍性,僅存在於有限的物種之間(如他們發現在小鼠中存在水稻的miR168),也是一個很有意義的發現。

從科學發展角度看,這本來是一件很正常的事;並且很明顯,這一研究結果如果成立,首先是對已有的生理學知識構成挑戰。奇怪的是,個別記者硬是把它與轉基因作物聯繫起來,杜撰和編造了這是「轉基因作物非常真實的危險」。「反轉」人士更是如獲至寶,似乎抓住了一根救命稻草,乘機造謠攻擊,矇騙公眾,將轉基因作物進一步妖魔化。

其實,張辰宇教授本人並沒有把他們的實驗結果與轉基因作物的安全性聯繫起來,可以說「連想都沒有想過」。他們在文章中只是說:「水稻中的一些小且易碎的核酸分子,在經受許多消化吸收屏障後仍能存活,並最終下調小鼠肝臟基因的表達,可能影響其膽固醇水平」。

一個新的科學發現必須接受同行實驗重複驗證和嚴肅認真的科學討論,然後才能得出正確的結論。「張文」發表到現在3年半過去了,國際上不少重複實驗的結果也已陸續發表,隨著時間的推移,結論已經比較明晰。本文提供一些最新的數據、評論和結論。

植物和動物細胞裡都有自己特有的 miRAN,它在生長發育中起著一定的調節作用(可查miRNA資料庫)。下表中列出了各種農作物、水果、蔬菜中高表達的小RNA。

檢測miRNA的方法有多種,如:微陣列(基因晶片)法(microarrays)、定量反轉錄PCR法(qRT-PCR,PCR為聚合酶鏈式反應的簡稱,是快速檢測基因的常用方法)、數字PCR(digital PCR)、測定RNA鹼基序列等等。由於這些方法的靈敏度很高,可測出含量很低的核酸分子;但因為核酸普遍存在,測定中因核酸汙染造成的假陽性也很常見。當檢測出的miRNA含量很低時,首先要考慮的是,是否存在汙染或儀器的背景噪音,而不應馬上為你測出了極低量的小RNA分子而狂喜。

迄今重複實驗的結果已有不少報導,歸納起來有兩方面:一是測出的植物miRNA更可能是汙染,是假象;二是植物miRNA在動物體內表現生理功能的可能性很小。

1,測出的植物小RNA可能是汙染,是假象

Snow等選擇了3種普遍食用的富含小RNA(MIR156a、MIR159a、MIR169a)的水果(蘋果,香蕉和鱷梨)作為檢測對象。這些miRNA高度穩定,且易於檢測。檢測常吃這些水果的健康運動員的血漿,結果是:人類本身具有的miR-16能夠檢測到,但沒有檢測到口服的三種植物miRNA(Snow 等,Ineffective delivery of diet-derived microRNAs to recipient animal organisms. RNA Biol. 10,2013)。

蜂蜜、蜜腺和花粉是蜜蜂的主要植物性食源,其中含有較高的MIR156a、MIR159a和MIR169a。在分析蜜蜂腸道時,可以檢測到蜜蜂本身具有的miRNA let-7,但檢測不到植物來源的MIR159a和MIR169a,在每個細胞中只檢測到一個MIR156a(Snow 等,RNA Biol. 10,2013)。

用富含植物miRNA(MIR156a、MIR159a、MIR169a)的蔬菜或大豆以及含動物酪蛋白或豬油的食品(含動物miRNA,沒有植物miRNA)分別飼餵小鼠,然後檢測小鼠血漿。沒有檢測到植物性的MIR159a和MIR169a。MIR156a在一個細胞中最多檢測到1個(Snow 等,RNA Biol. 10,2013)。

Snow按照「張文」的實驗設計,將未經處理的富含MIR156a、MIR159a和MIR169a的鱷梨飼餵小鼠,可以檢測出動物性的miR-16,除偶然檢測出極低量的MIR156a外,也沒有檢測出任何痕跡的植物MIR159a和MIR169a(Snow 等,RNA Biol. 10,2013)。

一些實驗室給動物飼餵不含有植物miRNA的飼料,竟然發現動物體內也有植物miRNA(Zhang Y等,Analysis of plant-derived miRNAs in animal small RNA datasets. BMC Genomics 13,2012)。

Witwer等用靈長目動物獼猴做了類似的實驗,餵食富含植物miRNA、不含動物miRNA的大豆和水果做成的奶昔類似物(shake)。飼餵後1、4、12小時採集血漿,用一種新的特異的RNA純化試劑盒和定量反轉錄PCR方法檢測。植物性的miRNA(MIR160、MIR166、MIR167、MIR168和MIR172)都沒有檢測到。用靈敏度極高、可以檢測出非常低含量植物miRNA的微滴數字PCR(Droplet digital PCR)法,也沒有檢測到植物性的miRNA(Witwer K.W.等)。

以上實驗的一致結論是:採用多種靈敏度極高的檢測技術,對靈長類動物,小鼠以及昆蟲做的飼餵植物性miRNA的實驗,都沒有能證實「張文」的結果,所以有人很保守地說,這最多只是「一個實驗室特殊技術或特殊實驗條件下的結果」(reflect a lab-specific technical or experimental condition),而不是「一個普遍的生命現象」(a general biological phenomenon)。

2013年英國Newcastle大學的Dickinson用小鼠做重複實驗,得出結論認為小鼠口服大米後,缺乏植物性小RNA進入血漿和肝臟的證據(Lack of detectable oral bioavailability of plant microRNAs after feeding in mice. Nature Biotechnology 31(11),2013)。實驗分以下處理:

表格的文字說明見下:

處理1:人工合成飼料(高度純化,完全去除植物性成分),測血漿;

處理2:人工合成飼料, 測肝;

處理3:營養平衡飼料(人工合成飼料加40%大米,含54 fmol/g水稻miR168a),測肝;

處理4:單餵大米飼料(大米佔75%,含水稻miRNA),測肝

飼餵小鼠1、3、7天後,取小鼠的血漿和肝臟做RNA測序,檢測結果顯示:

飼餵大米的處理,每100萬個miRNA中僅檢測出4-16個類似於水稻的小RNA。

只餵食合成飼料(沒有植物性miRNA)的處理中,也能檢測出類似於水稻的miRNA,其含量與餵食大米飼料的小鼠差不多。

這些與水稻小RNA類似的序列,經鑑定與miR414相似,在水稻穀粒中檢測不到它,但在所有小鼠樣本中都能檢測到相似的量,不管飼餵什麼樣的飼料。同時,用定量PCR法檢測飼餵三種飼料的小鼠肝臟和血漿,也沒有檢測到水稻的miR168a。

Dickinson認為,測出的與水稻小RNA類似的序列,可能是測序錯誤、即假象(artifact)或核酸交叉汙染所引起。他列舉了三點理由說明植物食品中的小RNA進入動物和人體血漿及肝臟缺乏證據。(1)Zhang Y.等 (BMC Genomics 13:381,2012)報告,經普查大量的動物小RNA公共資料庫,沒有證據說明有任何主要植物來源的小RNA在動物樣本中積累;(2)口服RNA藥物因常常被消化降解很少能成功生效;(3)植物小RNA有長期安全食用的歷史,沒有證據說明小RNA被吸收並有生理功能。

Dickinson的重複實驗中還測定了小鼠的低密度脂蛋白(LDL,low density lipoprotein),發現生食(未經煮熟)75%大米的小鼠,3天和7天後血漿中的LDL顯著增加,但飼餵營養平衡飼料(含40%大米和54 fmol/g水稻miR168a),小鼠的LDL則正常,沒有增加,儘管實驗中加入的水稻小RNA比「張文」中用的量高22倍。故「張文」所說的LDL增加,不是由於水稻中的小RNA(測不出)產生什麼生物學效應,而是因為僅僅生食大米、營養不平衡造成,因為飼料中的脂肪、膽固醇和蛋白質比齧齒動物的標準飼料要低。

張辰宇教授對Dickinson的報導做了回答(「Reply to Lack of detectable oral bioavailability of plant microRNAs after feeding in mice」)。有興趣的讀者可以去查閱,在此不再多做介紹。

今年5月,美國科學院舉辦了有關miRNA的專門論壇。論壇上認可Dickinson的工作,引用了他的實驗數據,而且還作了進一步的發揮。

2,植物miRNA在動物體內表現生理功能的可能性很小

由於國際上基本沒有實驗室能夠在動物和人類的血液和組織中檢測到口服植物的miRNA,所以沒有人能去檢查植物miRNA在動物體內所表現出的生理功能。

在美國科學院的論壇上,哈佛醫學院的一位教授作了一個主題報告,下面摘取他報告的2張幻燈片。.

第一張幻燈片指出,即使動物物體內檢測出植物性miRNA,因其在食物中的含量太少,不足以行使miRNA的調節功能(下圖):

圖中明確指出,如果在動物中確有口服植物miRNA的話,要行使其生理功能,必須達到每個細胞中有100個拷貝的miRNA才有可能。要達到這個量,需要一次吃1670公斤哈密瓜。水稻上也已有人做過計算,需要一次吃33公斤大米才有可能(見:Safety assessment of food and feed from biotechnology-derived crops employing RNA-mediated gene regulation to achieve desired traits: A scientific review. Regulatory Toxicology & Pharmacology 66:167–176,2013)。

第2張幻燈片是這位哈佛醫學院教授的結論:

以上只是簡介最近的國際研究動態和進展,絕無對張辰宇教授不恭之處。

下面要特別說一說miRNA與轉基因作物的安全性問題。

「張文」發表後,國內的「反轉」集團不久就掀起了一股聲勢浩大的反轉輿論,說張教授的結果衝擊了轉基因作物及其食品的安全性。那麼把miRNA與轉基因安全聯繫起來是怎麼來的呢?

現在查到的源頭文章是一個叫Ari LeVaux的記者發表在《大西洋》(The Atlantic )雜誌上的一篇文章,題為「遺傳改良食品非常真實的危險」(「The very real danger of genetically modified foods」)。 其中說:「 中國南京大學的研究者發現吃了米飯後,水稻裡的小片段核酸(RNA)到了人的血液和器官裡,與人的肝臟細胞受體結合,影響肝臟從血液中吸取膽固醇。」文章渲染來自水稻的miRNA損害了小鼠的基因表達。

在美國科學院論壇上,很多行內科學家和記者指出了《大西洋》雜誌文章的許多謬誤,記者Ari LeVaux後來也撤回了他的一些論點。但一些人仍然把這篇文章作為「救命稻草」,反對轉基因,國內反轉份子散布「miRNA衝擊轉基因安全性」的謠言也全都來自The Atlantic 雜誌的這篇文章。

人類吃稻米已有5000年以上的歷史,全世界50%以上的人口特別是亞洲以稻米為主糧,如果水稻裡的miRNA對人有害的話,試想今天會是什麼樣的情景?農作物、水果、蔬菜中歷來存在小RNA,並不是有了轉基因作物後才有小RNA。植物性食品的長期安全食用歷史,說明小RNA既與傳統非轉基因植物食品的安全性無關,也與轉基因作物(GMO)食品的安全性無幹,兩者之間扯不上任何關係。反過來說,如果「小RNA衝擊GMO食品的安全性」,那也一定會「衝擊傳統非GMO食品的安全性」。以上列舉的國際最新研究結果表明,動物血液和器官中測不出植物的小RNA,它更不可能在動物中行駛其調節基因表達的生理功能。這是很淺顯的道理和確鑿的事實,顯然,反轉者的鼓譟和責難只能是夢囈,在明眼人面前,各種謊言和謠言本來就不堪一擊。

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