中科院過程工程研究所白碩課題組設計了一系列Fmoc修飾的二肽，對嗜熱菌蛋白酶（Thermolysin）對短肽的選擇性催化作用進行了研究。實驗和計算模擬的結果表明，Thermolysin偏向催化特定的底物模式，該底物序列在連接Fmoc的第一殘基為親水性胺基酸，第二殘基為疏水性胺基酸。根據不同的底物設計，可控制Thermolysin催化短肽向水解或縮合兩種完全相反的反應方向發展。利用Thermolysin的雙向催化作用可實現一鍋法對短肽胺基酸序列的改變，並伴隨著凝膠-溶膠-凝膠的轉換。
短肽自組裝水凝膠的製備主要有兩種方法：化學合成法和酶催化法。其中，酶催化誘導自組裝策略可通過選擇性的短肽催化反應，協助短肽分子合成及有序排列，從而對組裝過程產生高度控制。嗜熱菌蛋白酶（Thermolysin）是一種具有熱穩定性的金屬內肽酶。隨著短肽自組裝技術的發展，Thermolysin在肽化學中的應用越來越廣泛，利用Thermolysin調控短肽的自組裝行為並製備一系列具有不同功能和形貌的短肽的研究越來越多。在以往的研究中，通過大量的酶抑制劑和分子模擬對Thermolysin的結構和催化機理進行了深入的研究，結果表明Thermolysin更傾向於催化含有疏水側鏈的底物。但由於不同肽分子與酶結合的複雜性，目前還沒有關於肽序列對Thermolysin催化反應作用機制影響的相關研究。因此，研究Thermolysin對短肽序列的結合能力和催化作用對酶催化誘導短肽自組裝領域的發展有著至關重要的意義。
通過分子層面設計改變胺基酸序列的親疏水性及羧基端，Thermolysin的催化作用在不同的底物中表現出了顯著的差異，催化反應會朝著完全相反的水解或合成反應發展。底物的疏水性是酶的活性位點結合的主要驅動力之一。因此，在分子水平上，中科院過程工程研究所白碩課題組設計了具有不同末端胺基酸的肽序列，採用HPLC測定Fmoc-二肽轉化率，並利用分子動力學（MD）模擬計算Fmoc-二肽與Thermolysin的對接複合物，在100 ns內計算Thermolysin的Cα原子的均方根偏差（RMSD），以評估MD模擬的穩定性。為了進一步研究二肽與Thermolysin之間的相互作用，利用MM-PBSA進行了結合自由能的計算，結果顯示Fmoc-二肽中胺基酸殘基的序列及親疏水性及會影響Thermolysin催化位點的結合能力，進而影響催化效率（圖1）。
圖1
進而，作者研究了亮氨酸醯胺衍生物（L-NH2）與Fmoc-X結合使用（其中「X」=Y，L，T，S），以探究Thermolysin引發短肽衍生物的縮合反應。當Fmoc-X與L-NH2的摩爾比為1：2/1：4時，隨著時間的延長，Thermolysin催化的縮合反應效率將達到一個恆定值，且Fmoc-胺基酸的疏水性越高，Fmoc-二肽的轉化率越高（圖2）。因此，可以推測Thermolysin在縮合反應中對疏水性胺基酸有更強的動力學偏好。
圖2
最後，利用Thermolysin的雙向催化作用，通過一個兩步反應可實現一鍋法改變Fmoc-二肽序列（圖3）。第一步，在Thermolysin的催化作用下Fmoc-YL逐漸分解為Fmoc-Y和L-COOH；基於Thermolysin催化的縮合反應，第一步反應產生的Fmoc-Y與後續添加的Y-NH2反應生成Fmoc-YY-NH2。酶催化的兩步反應完成了從Fmoc-YL-COOH到Fmoc-YY-NH2的分子結構轉變，。從宏觀上來看，這個兩步反應經歷了凝膠-溶液-凝膠的變化。相應地，這種酶觸發的二肽自組裝體系的形貌、二級結構及力學性能也相應的發生了變化（圖3）。
圖3
在文末，作者指出通過對二肽底物的分子設計，胺基酸的序列和疏水性對Thermolysin的催化反應類型和催化效率有很大影響。通過控制Thermolysin催化水解和縮合的雙向反應，設計並進行了一鍋-兩步反應以實現Fmoc-二肽序列的轉變。此研究對於通過Thermolysin在分子水平精確設計和控制肽序列、二級結構、組裝形態和力學性能，並進而調控肽自組裝水凝膠性質具有重要指導意義。
該工作以Research Article的形式發表在CCS Chemistry，並在官網「Just Published」欄目上線。
文章詳情：
Role of Thermolysin in Catalytic-Controlled Self-Assembly of Fmoc-Dipeptides
Meiyue Wang , Qiansen Zhang , Honglei Jian , Shijie Liu , Jieling Li , Anhe Wang , Qianqian Dong , Peng Ren, Xin Li & Shuo Bai*
Citation：CCS Chem. 2020, 2, 317–328
文章連結：https://doi.org/10.31635/ccschem.020.201900116
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