中國藥品生物製品檢定所王佑春研究員 楊佳/攝
12月1日，由中國生物技術發展中心、中華醫學會等有關單位舉辦的第四屆健康科技高峰論壇在中國生物技術學術中心舉行。本屆論壇結合「世界愛滋病日」，以「愛滋病防治研究的科技進展與展望」為主題，報告內容涵蓋愛滋病的預防、診斷、治療和疫苗研發等方面。中國網現場直播，敬請關注！中國藥品生物製品檢定所王佑春關於愛滋病診斷試劑研究的現狀的演講。
王佑春：我主要是從病毒方面，包括愛滋病、SARS方面的工作。愛滋病疫苗和有關試劑的質量控制是我們工作的一部分。今天很高興參加這次活動，結合我們的工作對愛滋病診斷試劑的研發狀況給大家匯報一下。
人類感染HIV病毒以後，病毒首先在肌體裡面複製。在複製的過程中，最先的是病毒核酸大量擴增。這個時候擴增量非常大，過一段時間以後能夠持續的維持低水平的核酸病毒量。在病毒擴張過程當中，很快會出現第二次抗原，再過一段時間這種抗體也會誘導出來。從病人感染到抗體檢測這段時間叫「窗口期」，在窗口期的時候，病毒傳染病非常高，這是一個常規的方法，抗體是監測不到的，但是感染率非常高。HIV感染以後，研究各種各樣的病毒試劑，對HIV病毒感染進行檢測。這種診斷試劑到目前為止，國際上、國內研究的試劑主要有以下幾種：抗體監測試劑，包括確認試劑，還有快速監測試劑，還有通過唾液和尿液的監測試劑。另外就是抗原檢測試劑，還有抗原抗體聯合體的試劑，還有核酸檢測試劑。
最近幾年，對耐藥物學研究比較多，我們國內也有一些單位在研製耐藥性試劑，而且國外有兩家已經研製出了，有的在中國開始申報。下面我把每一類診斷試劑的情況，包括國內、國外的情況簡單向各位匯報一下。抗體檢查試劑主要是通常所說的免檢免疫的診斷試劑，到目前為止，這類發展到了第四代。在HIV剛剛發現的時候，那是85年，那個時候巴林診斷試劑第一代的特點是所用的抗原是完全從細胞提取的抗原，作為HIV的抗原來進行檢測。這種抗原包括細胞的成分比較多，而且病毒各個現段都有。隨後就發展到第二代診斷試劑，主要採用基因工程的辦法，對它有目的性的抗原進行工程表達，然後作為簡單試劑的抗原。但是第二代主要是檢測抗HIV病毒的另一個抗體，所以叫它間接法。這類診斷試劑在診斷過程中檢出相對比較晚，但是也有局限性。
後來發展到第三代。在第二、第三代的時候涉及到了創新。在這個創新過程中，第二代是用於檢查，但是不是所有的能表達的抗原都能夠進行，也就是說到90年代初，國外能夠對這一進行改進，這種抗原可以很好的進行酶標被，它檢測的是總的HIV抗體，所以它的特點比第二代大大的提高了。第三代是我們國內和國際上使用的是關於臨床篩查的主流試劑。
最近幾年發展到第四代診斷試劑。HIV抗體和抗原聯合起來，同時檢測。大家都知道，如果是聯合檢測，抗原、抗體肯定有反映，但是檢測的片斷不一樣。我們檢測抗體的時候是檢測模具抗體，檢測抗原的時候是檢測HTV2的抗原，這樣在一個反映裡面既可以檢測到HIV抗體，也可以檢測到第二次抗原。通過前面的模式圖可以看到，第二次抗原出現比抗體出現早一些，這部分診斷試劑國外已經有了一些，國內有兩家已經開始註冊，也用於血液篩查。
我們對用於血液篩查的診斷試劑，從1994年下半年，就開始實行PP檢定。尤其最近，大家對PP檢查比較熟悉，實際在94年下半年，用於血液篩查的那個時候衛生部開始實行PP檢。包括B肝抗原、B肝抗體、血型，加上HIV抗體。當時在檢查的時候不是都合格的，不合格率有相當一部分，有專門的監督管理部門去監督。最近幾年，隨著工藝穩定，PP檢的合格率越來越高。從07、08年，基本上在HIV方面都是合格的。
2007年HIV診斷試劑用於血篩查的診斷情況
第三代在2007年所有進入PP檢查的診斷試劑有17家企業，總共生產103批，產量是7500萬人份，其中國產16家，有91批，國產產量是6800萬，佔總產量的91%。進口的只有1家，是12批次，大約有600萬，大約佔8.9%。07年第四代試劑共有3家，都是進口的，總共申報12批次，有600多萬人份。在07年全年用於血液篩查或者這類的診斷試劑，一共進入國內市場8100萬人份。其中在第三代、第四代中，我們的國產試劑佔84.2%。所以說，大部分的診斷試劑用於血篩查的都是國產的診斷試劑。
我們對08年的診斷試劑的PP檢的情況也進行了總結。這個數據截止到9月底，第三代試劑到9月底總共有18家申報，有91批，有6500多萬，都是合格的。其中國產的是17家，有82批次，生產了6000多萬，約佔95%。今年第四代診斷試劑除了前年的進口3家診斷試劑以外，我們還有兩家國產診斷試劑獲得了批准，正式生產，也投放了市場。在這五家企業當中，總共9個批次是200多萬人份，將近300萬，國產是49萬，剛剛開始申報，量比較少，明年可能會有所增加。進口的3家企業，是6批次，有200多萬人份，所以進口佔多數，但是國內一些企業在研製這種試劑，全年總合格率到9月份是7000萬人份，其中國產的佔71%左右。
我們對這幾年的試劑進行了比較，除了檢驗合格以外，我們還對一些指標進行了更細化的分析。這個表格像07年對靈敏度和陽性檢測率的檢測，最低檢出線6份裡面有3個，從這個結果看出有一些是符合最低要求的。38批是在6份中測出4份，它的要求不能高。而且對於陽性參考陰性進行了分析，有20個陰性，這樣能夠測出18份，是陰性的就符合了要求。我要說明一下，20份中的2份不是整個流行的狀況是百分之多少，實際上這裡面的樣品都是特殊的樣品，並不是代表流行病學的狀況。因為我們要選擇有代表性的，能控制特性的指標，很多陰性裡面就是很多試劑出現假陽性，所以20份裡面如果有18份檢測出陰性，這是符合要求的。我們對第四代診斷試劑進行了進一步分析，第四代既有檢測抗體，又有檢測抗原。我們在做它的評價時，對第四代診斷試劑的抗體情況和第三代相同，起碼不能低於第三代診斷試劑抗體的水平，這樣才能夠保證抗體的指標。在這種情況下，我們對它的抗原也進行了評價，可以看到不同廠家的抗原檢測情況也是不一樣的，有的是5A、2.5A、3.2A，現在是屬於有規律的，現在對它的特點也進行了分析。
從流行病學來講，我們對不同的國內的、國外的診斷試劑，還有進口的診斷試劑，對它們進行了分析。很多是用自己的不同的亞性對這種診斷試劑進行比較和分析。從自己的分析來看，所有國內國外的診斷試劑，被檢測的時候是沒有太明顯的區別。但是檢測PC重組的時候可能會出現一定差異，可能在關鍵的時候會出現一些差距。另外，我們還用國際上的參考點進行分析，這是從美國、英國的研究中所制定的參考點，我們用這套參考點對國內上市做PP檢的診斷試劑進行比較分析，但是它們的能力是不一樣的。我們還有其他的A亞性、C亞性，不同試劑檢測不同亞性的靈敏度還是有區別的。
國內有HIV2的病毒，這些檢查試劑基本上都可以測試到，但是強度不一樣。需要注意的是O組，前面講的A、C都是M組的。O組的能否檢測出來，因為這組病毒數量只是很小的一部分，這部分是不是能夠檢測出來，我們也進行了分析。可以看到，下面的試劑對O組的檢測效果是比較好的，中間的試劑對O組的亞性樣品是檢測不出來的，這樣說明我們國內的檢測試劑在質量提高方面，在進一步提高檢測能力方面還有待進一步提高。
診斷試劑進行評價最好的是陽轉血清。就是這個人從沒有感染之前，就開始收集他的樣品。到他感染以後，出現核酸、抗原、抗體，用動態學的系列進行評價，這是評價診斷試劑最好的樣品。也就是看什麼時候能夠檢測出來，檢測的時間早還是晚。我們通過從美國的BBI公司購買了這種陽轉血清來評價我們的試劑。這張圖的基線下面是檢測時間短於對照試劑，基線檢測時間是早於對照試劑。從這個結果可以看到，我們總共第三代試劑8家，在這8家中有2家是低於國外試劑的。實際上有4家是高於國外試劑的，後面的4個都是第四代診斷試劑。通過這個可以看到，我們國內的試劑並不比國外差，有些檢測試劑時間早於國外的。從前面的分析來看，主要是用於血液篩查的診斷試劑質量得到了很大的提高，與國外的診斷試劑沒有明顯差異，而且我們國內用的大部分都是國產發明的。
對確證試劑來講，前面用篩查試劑檢查出來，確證試劑有兩種，包括蛋白印跡法和線性免疫分析技術法。線性免疫分析相對比較好。這兩類試劑在國內有兩家進行了註冊，國內至少有4家在研究。最近對確認試劑的使用可能有不確定的情況比較多，所以我們對這些樣品也進行了分析，用國際上三種比較好的診斷試劑來檢測不確定的藥品，然後看檢測效果怎麼樣。總共用了64份對樣品進行檢測，可以看到第一種確認試劑檢測出56分是陰性的，另外8份是不確定的。所以對不確定樣品你還要追蹤三個月再檢測一次，看抗體有沒有變化，如果沒有變化就可以判斷是陰性，如果有變化就確定為感染。確認以後，檢測出來的不確定率就比較高，尤其是64份裡面有53份確定了，這種有反應是微弱的，剛剛陽性的，我們拿不準是陽性還是陰性的，需要確認。在這裡，有的確認試劑反而不能夠給你很好的診斷結果，確認之後還是不確定，這個工作量就增加了。實際上所有的都進行了核酸檢測，有的還進行了追蹤。
膠體金類快速檢測試劑這幾年發展的很快。它的特點是在檢測的時候用儀器，保存時間比較長，使用起來比較方便，這是它的特點。在審批這部分試劑過程中，是要嚴格的檢驗，另外集中病人來進行手術。國內至少有7家企業生產這種試劑，而且國外有兩家在中國進口，還有企業也在研究，這類試劑在國內到國外出口的也有一兩家。
還有抗體診斷試劑，包括尿液抗體檢測試劑，現在有一些檢測唾液的檢查。現在有一家ELISA試劑獲準生產，還有多家企業在研製這類產品。另外還有唾液抗體檢測試劑。除了前面說的以外，還有新技術檢測HIV抗體診斷試劑。主要包括化學發光法和時間分解法。化學發光法的優點是靈敏度比較高，檢測效果比較好。如第四代檢測試劑檢測出陽性，你可以檢測出是抗體陽性還是其他的，這種方法國內在慢慢使用和研究，化學發光法是經過了研究的。
除了抗體的診斷試劑以外，另外還有抗原檢測試劑。這個診斷試劑的用途在很早的時間，美國用了一段時間成本太高了，而且沒有篩選出來，這個試劑目前主要用於實驗室，對藥物篩查或者研究過程來用。國內最早也批過P24，但是現在基本不生產了。HIV鑑定診斷試劑的用途，它主要是檢測窗口期的情況，減少窗口期傳播風險。實際在國外用這個東西比較多，尤其用於獻血員的篩查。國內在申報方面有3家企業，已經有4家企業在做了。3家企業申報的所有東西已經做完，另外還有進口試劑，這些檢測試劑有一批已經註冊。核酸用於血篩查的檢測試劑也是最近一兩年。
另外還有核酸定量檢測試劑，這個在我國的時間比較長。它主要對病程監控、效果進行檢測，預防和要了解檢測情況怎麼樣，有很多已經開始使用。我們國內所用的這種方法大部分主要使用核酸檢測試劑，國內現在使用螢光檢測法在這種檢測試劑裡面，有一些已經通過了，有一些單位已經在研製和申報。這部分的診斷試劑大部分都是國外的，現在很多的實驗室都是國外的，有很多實驗室都在使用。這裡有幾個已經註冊，有幾個正在註冊中。
對定量來講，最主要的就是要看不同的試劑之間檢測的是不是一樣的。不同的試劑表現方法是不一樣的，有的適用拷貝表，有的使用單位表格，我們在換算過程中要換算成國際單位進行表述，來分析不同的試劑檢測結果。也就是說，這個試劑檢測是多少，和那個試劑檢測的數據有沒有可比性。對在國內註冊的6家試劑都進行了比較，從這個結果可以看到，大部分都沒有明顯的差別，也就是說他的標準不在考慮之內。像這些它們的相關係數也是非常高的。如果抗病毒治療的時候，前面用一個試劑，後面用另外一個試劑，那麼用藥的效果和檢測的效果就會反映出來，並不是說這些試劑不能用，但是要客觀的用藥的情況。而且我們對他們病毒檢測情況，在不同的範圍內檢測結果不一樣，因為在不同的範圍有不同的情況。所以在使用的時候，尤其更換試劑過程中，要對治療效果進行更好的評價。
關於試劑研發的關鍵步驟
在實際研發過程中有主要的幾個步驟，一個是主要原材料，包括抗原、抗體、核酸引物以及核酸探針等。另外工藝的優化以及確定，實驗室的質量分析和臨床研究。在實驗室質量分析過程中包括以下的指標，包括分析靈敏度、分析特異性等等。對目前已研製出的參考品來講，有很多HIV抗體的參考品，要對國內產品進行標化。如果沒有國內的標化，要根據國外的情況來研製。現在基本上愛滋病的所有診斷試劑都已經研製出來包括抗體的、快速的、確認的、唾液的、尿液的。
還有臨床評價的意義及目的。臨床前樣品雖有代表性，但數量畢竟有限，並不能完全代表臨床情況。遇到特殊的情況還要進行特殊的說明。
臨床過程中還要考慮其他的情況，最主要的要考慮樣品的情況、人群的情況、樣品來源的情況。還要有對照試劑，如果沒有，要用其他的臨床方法。
最後，我國愛滋病試劑的研發和生產是多樣化的，有些試劑已經規模化生產，有些正在研發中。用於血液篩查的試劑進行嚴格的管理，實行批批鑑定，而且國內的診斷試劑和國外的基本沒有區別，國外最近對我們的試劑也進行了研究，認為我們的試劑質量還是不錯的。核酸檢測試劑發展相對較慢，和國外相比較，確實存在一定差距。今後包括科技部或者其他部門能夠加強這方面的資助，促進核酸試劑的發展，對我國的HIV試劑發展可能更好。