本期特邀分享：四川大學分析儀器研究中心段憶翔課題組李丹碩士發表在《Nanoscale》的一篇三維DNA Walker領域研究工作，文章題為「An Enzyme-Mediated Universal Fluorescence Biosensor Template for Pathogen Detection Based on Three-dimensional DNA Walker and Catalyzed Hairpin Assembly」。這篇研究通過動力學研究，探究了不同聚腺苷酸長度對於病原菌檢測性能的影響，並建立了用於多種病原菌檢測的傳感器模板。
由食物和水等傳播途徑引起的病原菌傳染病對公共衛生和全球經濟構成日益嚴重的威脅。根據世界衛生組織的統計數據，每年世界上幾乎有十分之一的人因食用受汙染的食品而生病，因此為了防止病原菌傳染病的傳播，開發一種超靈敏、高準確的分析檢測方法對食品安全、全球和公共衛生都具有重要意義。本研究基於三維DNA Walker和催化髮夾組裝反應構建了一種用於病原菌檢測的螢光生物傳感器。在文中通過改變構建功能性納米金的聚腺苷酸（PolyA）長度，探究了納米金表面DNA探針的密度和構型對傳感器性能的影響，實現了鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌的靈敏檢測；同時，構建的傳感器具有高特異性，且能應用於實際樣品的檢測。
1.通過研究Vmax、Km和Kcat的變化，明確了納米金表面DNA探針密度對檢測性能的影響。
2.構建了一種傳感器模版，通過簡單的鹼基改變實現不同目標物的靈敏分析。
構建的病原菌檢測體系可分為三個階段（圖1所示），第一階段：鏈置換反應—通過病原菌與特異性核酸適配體的高結合力，使得與適配體互補的核酸序列（c-Apt）以自由狀態釋放在溶液中。第二階段：DNA Walker反應—釋放的c-Apt作為行走鏈與DNA Walker的軌道發卡探針進行鹼基互補配對，並在限制性核酸內切酶（Nt.BbvCI）的特異性驅動下，逐個釋放酶解片段（Ef）。第三階段：催化發卡組裝（CHA）反應—Ef片段作為CHA反應的引發鏈與設計為發卡結構的H1結合釋放出H1的功能域；隨後H1的功能域與H2鹼基互補配對將Ef片段釋放，形成H1@H2的二聚體；最後在分子信標F@Q加入後，H1@H2與F鏈結合導致螢光基團與粹滅基團分離而產生被螢光光譜儀檢測的螢光信號，實現目標物的高靈敏檢測分析。
為了探究不同長度PolyA對檢測性能的影響，文章中對米氏方程和動力學參數進行了計算和比較，將數據整理在圖2中。圖中通過對米氏常數（Km）和轉化數（Kcat），Kcat/Km，Vmax和檢測限的計算，結果發現當PolyA長度為10時，處於這一狀態的功能性納米金是酶的最佳底物，對鼠傷寒沙門氏菌的檢測達到了22.8 CFU/mL。文章中採用相同的實驗和計算方式，對大腸桿菌也進行了螢光測定和數據統計，實驗結果得到了相同的結果，PolyA的最佳長度為10，實現了大腸桿菌的靈敏檢測，檢測限為28.1 CFU/mL。產生這一現象的原因有三個：首先，適當數量的DNA表面覆蓋導致AuNP表面帶負電荷的磷酸基團數量減少，降低了AuNP表面鹽濃度，使得受鹽濃度影響酶解效率現象降低；其次，適當的PolyA-DNA附著在AuNPs表面可以防止DNA探針的非特異性吸附，從而使探針保持直立方向，方便目標鏈和PolyA-DNA的雜交和提高酶解效率。最後，適當的PolyA-DNA改變了最終DNA探針在AuNPs表面的密度，大大降低了相鄰DNA鏈間的空間和靜電排斥。
圖2. 表面覆蓋率對生物傳感器檢測性能的影響。
為了探究不同長度PolyA對檢測性能的影響，文章中對米氏方程和動力學參數進行了計算和比較，將數據整理在圖2中。圖中通過對米氏常數（Km）和轉化數（Kcat），Kcat/Km，Vmax和檢測限的計算，結果發現當PolyA長度為10時，處於這一狀態的功能性納米金是酶的最佳底物，對鼠傷寒沙門氏菌的檢測達到了22.8 CFU/mL。文章中採用相同的實驗和計算方式，對大腸桿菌也進行了螢光測定和數據統計，實驗結果得到了相同的結果，PolyA的最佳長度為10，實現了大腸桿菌的靈敏檢測，檢測限為28.1 CFU/mL。產生這一現象的原因有三個：首先，適當數量的DNA表面覆蓋導致AuNP表面帶負電荷的磷酸基團數量減少，降低了AuNP表面鹽濃度，使得受鹽濃度影響酶解效率現象降低；其次，適當的PolyA-DNA附著在AuNPs表面可以防止DNA探針的非特異性吸附，從而使探針保持直立方向，方便目標鏈和PolyA-DNA的雜交和提高酶解效率。最後，適當的PolyA-DNA改變了最終DNA探針在AuNPs表面的密度，大大降低了相鄰DNA鏈間的空間和靜電排斥。
圖3. 生物傳感器的特異性驗證。
生物傳感器的成功構建不僅需要獲得靈敏度，還需要滿足特異性的要求。圖3對鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌檢測體系進行了特異性驗證，從低中高三個層面檢測螢光強度，實驗結果均表明了良好的特異性，而這一特異性取決於核酸適配體和細菌的高特異性結合。
本研究構建了一種螢光生傳感器實現病原菌的分析檢測，文章中主要探究了納米金表面DNA探針的密度和構型對檢測性能的影響。然而文章中還存在不足：構建的檢測體系只能實現一種病原菌的分析檢測，而不能實現多種細菌的同時檢測，這對於實際應用能力有所影響；而且構建的三維軌道存在不穩定性，容易受到周圍環境的影響而發生團聚。在之後的研究中可以著重關注這兩個問題實現病原菌的更好檢測。
四川大學分析儀器研究中心（RCAI）由國家級特聘教授段憶翔教授於2010年創建。RCAI重點開展高端分析儀器研發、應用及產業轉化。RCAI研究領域包括：1.雷射光譜儀器的研發；2.質譜儀器的研發；3.高端分析儀器的研發；4.新型傳感器及光纖傳感技術；5.分析儀器用於體外醫學診斷。
原文連結：https://doi.org/10.1039/D0QM00266F
撰稿人：四川大學生命科學學院分析儀器研究中心 李丹
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