生信精講｜TCGA&GEO挖掘，預測腎細胞癌患者預後，精彩

題目：Construction and Validation of a 9-Gene Signature for PredictingPrognosis in Stage III Clear CellRen

譯名：預測Ⅲ期透明細胞腎癌預後的9基因信號的構建與驗證

摘要

目的

建立一個多基因信號，以幫助更好地III期腎細胞癌(RCC)患者的預後進行預測。

方法

★從GEO資料庫中下載GSE53757數據集，包括14對癌症和正常組織的表達數據，從TCGA資料庫中下載16對mRNA，表達譜數據(下載的是RNA-seq測序數據，需要提取mRNA數據)。

★差異表達分析，對共同差異表達基因進行進一步分析。

★對TCGA中選擇腎癌Ⅲ期病例 (N=122)進性lasso cox回歸，篩選和建立預後多基因信號。在FUSCC資料庫中選擇腎癌Ⅲ期病例(N=77)對多基因信號進行驗證。

★對所有病例(N=199)預測總體生存時用C-index和time-dependent ROC檢驗多基因信號的有效性。

結果

1.TCGA和GEO兩個數據集中共找到1370個差異表達基因。

2. Lasso cox 回歸模型找到9個mRNA,構建分類器將腎癌III期病人分為高風險組和低風險組，在TCGA患者(N122)中、FUSCC患者 (N=77)中、以及TCGA和FUSCC所有患者(N = 199)中預後差異非常顯著(p<0.01)。

3.對完整數據(N=199)進行多因素cox比例回歸，發現9個基因信號分類的風險組、診斷時的年齡、pNstage、ISUP grade為總體生存的獨立的預後因子。

介紹

腎癌是全世界最常見的泌尿系腫瘤之一，2018年美國估計有近65 340例新病例和14 970人死亡。腎細胞癌的發病率(RCC)在中國也在增加。目前，預後預測主要是根據RCC患者的病理分期。

目前，臨床上推薦採用腫瘤轉移(TNM)分類系統進行腫瘤分期。然而，各亞組之間存在看明顯的生存差異。四型腎感患者(T3NOM0，5年生存率：20-70%；T1-3N1MO，5年生存率：0-20%)(5)。雖然UICC/AICC TNM分期系統的最新版本(第8版)已經發布，但這個問題仍然存在，未解決，從而限制了該系統在判斷預後方面的應用，以指導臨床實踐。因此，需要有更好的信號來幫助預測III期腎癌患者的預後。

此外，III期RCC患者的全身治療仍在發展中。幾項研究聲稱，在手術後接受索拉非尼或舒尼替尼的III期患者有更好的療效。與安慰劑相比，無疾病生存期(DFS)，但總生存期(OS)相似。據報導，PazopanibNivolumumab在轉移性RCC患者中有效，局部晚期腎癌患者的輔助治療安慰劑沒有顯示出保護作用。佐劑和新佐劑nivolumab臨床試驗仍在進行中，但希望它們能顯示出良好的效果。ipilimumab的使用也可能是有希望的。因此，建立更準確的III期腎癌患者預後分類系統，對指導更好的管理策略具有重要意義。

材料和方法

病人和公共資料庫

GSE53757、14對癌症和正常組織樣品。

TCGA資料庫(通過UCSU-Xena下載)level3 mRNA數據，16對腎癌III期患者癌症和癌旁組織樣品。

●TCGA中122例腎癌III期患者有完整的臨床和生存信息，訓練集。

FUSCC資料庫中77例接受根治性腎切除術的患者，驗證集。

●共研究就199名腎癌III期患者基因表達數據和臨床信息。

公共數據的處理

★GEOquery包下載晶片數據、gcrma包對數據進行標準化.

★探針ID轉換為EntrezGenelD，多個探針匹配到一個EntrezGenelD,取均值。

識別差異表達基因

★對GEO數據使用paired t-test識別差異基因，並用FDR矯正p-value,p-value < 0.01並且[logFC|>1為差異表達

基因、TCGA數據做同樣分析(也可以用limma包)，取共同差異表達基因。

RNA提取、反轉錄、qRT-PCR

在FUSCC驗證集中提取77名患者的總RNA，進行RT-PCR，以ATCB基因作為內參基因，ACt表示基因的表達水平，△Ct(A gene)= Ct(A gene) - Ct(ATCB gene),Ct值越大表示模板的初始濃度越低，也就是gene的表達量越低。所以△Ct值越高，初始表達量越低。

風險得分計算和統計分析(TCGA數據)

生存時間：

data of surgery to the date of death

last follow-up

差異表達基因篩選：

lasso cox 回歸(R-glmnet包)對差異表達基因進行篩選，減少差異表達基因的數量，並且得到篩選後的基因的回歸係數。

★ 根據風險得分將患者分組：

☉根據篩選後的基因的表達量和患者總生存時間，通過X-tile軟體，對篩選後的每個基因分別尋找最佳cutoffs。

☉然後根據各自cutoffs，將篩選的基因分為高表達基因和低表達基因，一般高表達基因用1表示，低表達基因用0表示。

☉根據每個基因的回歸係數與表達狀態(高/低表達)計算每個患者的風險得分，使用風險得分中位數將患者分為高風險組和低風險組。

生存分析：

使用KM法驗證高風險組和低風險組的患者生存時間是否有差異，生存信息來自TCGA資料庫患者和FUSCC資料庫患者，分別對訓練集(TCGA) 驗證集（FUSCC），整合數據（TCGA + FUSCC）進行生存分析。

COX回歸分析：驗證風險組是否為獨立預後因子。

Time dependent ROC:在每個數據集中評估風險得分的預測準確度。

C-index：表示一些預後因子的影響。

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