如何進行血清外泌體的miRNA標誌物的生信數據挖掘?本文告訴你研究套路!

2021-01-21 醫學方


細胞外囊泡（EVs）在近兩年大火，成為發SCI和申請國自然的熱點。EVs的其中一個重要的應用就是可以作為標誌物用於疾病的診斷，血清的外泌體在體內循環，可以作為無創標誌物去分析，是一個很好的研究方向。而通過生物信息學手段挖掘疾病標誌物已經有很多文章，那麼外泌體的標誌物又怎樣去通過生信分析呢？在這裡，總結了最近剛剛發表的幾篇血清外泌體的RNA標誌物文章，分析其中用到的思路，工具和研究套路。


第一篇文獻是發表於期刊《Journal of Cancer》，影響因子3.182，核心是通過生信+實驗驗證手段，去發現肝轉移（LM）的結直腸癌（CRC）患者的新型循環外泌體miRNA標誌物。


在GEO資料庫中手動搜索後，選擇了三個數據集（GSE35834，GSE81581，GSE98406），這些數據對miRNA在大腸肝轉移，原發性大腸腫瘤和正常大腸黏膜中的表達譜進行了比較分析。結果發現，miR-122的表達在結直腸肝轉移組織中始終顯示出最高的差異倍數變化。並驗證了組織性miR-122的表達水平，發現與原發性大腸腫瘤和正常大腸黏膜相比，miR-122表達在大腸肝轉移中顯著升高。另外，miR-122的表達在CRC細胞系中明顯更高，特別是在SW620細胞中。


這裡驗證採用的就是實驗手段。從患者血清和細胞系上清，分離了外泌體。首先使用透射電子顯微鏡TEM和WB確定分離出來外泌體，緊接著觀察到miR-122在血清中的表達與從等體積血清中分離的純外泌體的表達沒有差異。切除腫瘤後，血清外泌體miR-122的表達明顯下調。我們發現CRC患者血清中外泌體miR-122的表達與CRC組織中的表達呈正相關。接下來，通過使用HT29和SW620細胞確認了外泌體miR-122在培養基中的分泌潛力。研究觀察到兩種細胞系在培養基中外泌體miR-122的表達隨時間和細胞數量的增加而增加。


由於血清外泌體miR-122升高是腫瘤來源的，因此想知道外周血中的外泌體miR-122是否可以預測CRC患者的預後。使用Kaplan-Meier生存分析來探討血清外泌體miR-122表達與CRC患者的臨床結局的關係，結果表明，高血清外泌體miR-122表達的CRC患者，尤其是LM患者。單因素分析表明，血清外泌體miR-122的表達，TNM分期，淋巴結轉移以及肝轉移狀況與CRC患者的OS顯著相關。多因素分析表明，血清外泌體miR-122表達和肝轉移狀況是CRC患者OS的獨立預後因素。


第二篇文獻是發表於期刊《Frontiers in Genetics》，影響因子是3.517，也是通過GEO資料庫分析與在線程序GEO2R集成來選擇候選circRNA，再通過qRT-PCR和ROC分析測試circRNA的表達和診斷用途。


在分析GSE100206和GSE100063數據集中circRNA的差異和豐度表達後，鑑定出59倍變化≥1.5和P值<0.05的循環外泌體circRNAs為差異表達circRNAs。研究選擇hsa-circ-0004771進行研究，因為在前10個上調的基因中，hsa-circ-0004771的表達最為豐富。ROC分析表明，循環外泌體hsa-circ-0004771對將CRC患者與HCs區分的診斷價值非常高。為了進一步證實結果，我們招募了10名CRC患者和10名健康對照，並通過TEM，western blot和nanosight粒子跟蹤分析驗證了從臨床血清樣品中分離出的外泌體。通過qRT-PCR與HCs相比，在CRC患者血清中始終觀察到表達上調。ROC分析表明，循環外泌體hsa-circ-0004771的AUC為0.92，以區分CRC患者與HCs。


為了驗證循環外泌體hsa-circ-0004771的表達失調，對110例CRC患者，35例BID患者和35例HCs的血清樣本進行了測試。發現I / II期CRC患者血清中外泌體hsa-circ-0004771的表達顯著上調，靈敏度為81.43％，特異性為74.29％（P <0.001）。卡方檢驗顯示循環外泌體hsa-circ-0004771的表達與TNM分期和遠處轉移顯著相關。


循環外泌體hsa-circ-0004771升高來源於腫瘤

為了探究循環外泌體hsa-circ-0004771的起源，檢查了十對從CRC患者手術前後收集的血清標本。結果表明，循環後的外泌體hsa-circ-0004771的表達明顯降低，這表明外泌體的hsa-circ-0004771的表達增加可能是腫瘤引起的。exosomal hsa-circ-0004771的相對表達結果也已通過TEM，nanosight粒子跟蹤分析和Western印跡得到了證實。在CRC細胞的培養基（HCT-116和SW-480）中顯示，外泌體hsa-circ-0004771表達的增加取決於細胞數量和培養時間。此外，我們應用了已知的外泌體阻滯劑GW4869來抑制外泌體的分泌。我們發現外泌體hsa-circ-0004771的表達在培養基中顯著下調，但在CRC細胞中沒有顯著變化。


其中，第2個這個問題，是因為是篩選得到候選標誌物，並不一定在外泌體中就存在。需要做一些小規模的實驗，收集一些患者和健康樣本來驗證以下是外泌體中表達篩選得到的RNA標誌物，而且在患者和健康對照中存在差異。第4個問題是外泌體也可以是正常組織分泌。循環外泌體標誌物的上調，來源於腫瘤組織會更加有臨床意義。於是可以總結成一種比較成熟的研究思路：

首先通過資料庫分析疾病表達譜，篩選得到候選的RNA標誌物，視數據集來源可以篩選得到miRNA或者circRNA等等。這個就和選擇的疾病以及能夠查到的數據集有關。然後通過建立獨立陣列去驗證，再在細胞系上通過測定時間相關的分泌量和阻斷實驗去研究外泌體的來源。

細胞外囊泡是近兩年最大的研究熱點，近幾年各種RNA標誌物輪流登上舞臺成為科學家們追捧的對象，miRNA，lncRNA 和circRNA也是發文章常見的標誌物。通過生信+實驗的結合，不僅能夠很好的結合熱點去挖掘新的標誌物，這些RNA標誌物的鑑定也是通過qPCR即可，實驗比較簡單，也有很多的現成成熟的服務。這也適合想要抓住熱點研究，但是苦於前期沒有數據的醫生，通過生信積累一定工作量和實驗數據，後期再進行實驗的研究。標誌物的研究可以通過結合熱點領域來進行創新，循環外泌體是一個研究的前沿，大家在暫時沒有其他創新想法的時候可以考慮這種思路。


「醫學方」現正式向粉絲們公開徵稿！內容須原創首發，與科研相關，一經採用，會奉上豐厚稿酬（300-2000元），詳情請戳。


「醫學方」始終致力於服務「醫學人」，將最前沿、最有價值的臨床、科研原創文章推送給各位臨床醫師、科研人員。



醫學方已推出「實驗室基礎」「SCI寫作技巧」「文獻精讀與解析」「醫學英語輕鬆學」「國自然基金申請」「臨床數據挖掘」、「基因數據挖掘」、「R語言教程」、「醫學統計學」、「微創動物實驗培訓」等多個專題課程，如需了解課程詳細推文，可關注「醫學方」公眾號，點擊「精品專題」進入


騰訊課堂：https://medfun.ke.qq.com

網易雲課堂：http://study.163.com/u/ykt1467466791112

客服電話：15821255568

客服微信：yixuefang1234


溫馨提示：醫學方還設有專門的討論群哦~各位明星導師都在群中，可以解答各位的遇到的問題，如有興趣，可以加客服微信後加入群聊

相關焦點

  • 文獻精讀:結合生信數據,挖掘外泌體研究套路
    今天跟大家解讀一篇外泌體相關的文獻，這篇文章同樣綜合了多個熱點，包括幹細胞、外泌體、小分子 RNA 和生信分析，是一篇非常適合學習的參考文獻。生信數據挖掘發現 ADAM9 是 miR-126-3p 的靶基因　　主要是分析了 GEO 資料庫中的胰腺癌基因表達譜，做了韋恩圖，用 R 軟體 limma 包分析得到了 GEO 樣本共有的差異表達基因 ADAM9, 然後通過 5 個 miRNA 靶基因預測網站（TargetScan , miRSearch, miRTarBase, miRWalk ,mirDIP；這幾個網站的網址文中都作了註明
  • Hepatology:鑑定血清外泌體中與膽管癌相關的蛋白生物標誌物
    為了尋找新的生物標誌物，來自西班牙的研究者，利用高效的外泌體分離方法，分別從CCA、PSC，和HCC患者的血清樣本中分離得到外泌體，運用蛋白質組學技術從中篩選出新的生物標記物，具有作為臨床診斷工具的潛在應用價值，研究結果發表在國際著名期刊Hepatology上。
  • 非編碼RNA和外泌體咋弄？內附20多外泌體高分套路、技術資料
    、表觀遺傳研究套路、非編碼RNA研究套路、耐藥研究套路代謝疾病研究套路、神經自噬研究套路、呼吸免疫研究套路、炎症微環境研究套路外泌體研究套路、腫瘤轉移研究套路、淋巴免疫研究套路、幹細胞研究套路消化研究套路、免疫炎症與自噬、骨科基礎研究套路、耐藥基礎研究套路
  • ...發現外泌體miR-24-3p抑制T細胞功能可作為鼻咽癌預後潛在標誌物
    最近的研究表明，細胞外microRNA不僅是潛在的生物標誌物，而且參與細胞間的相互作用來調節各類型惡性腫瘤中癌細胞與其所在微環境之間的交流。8月19日，來自中山大學腫瘤防治中心的李疆研究員在國際著名病理學期刊The Journal of Pathology（IF= 7.381）發表文章，揭示了外泌體miR-24-3p靶向FGF11抑制T細胞功能可作為鼻咽癌預後的潛在標誌物。研究從鼻咽癌（NPC）細胞系、患者血清（T-EXO）、NP69細胞和健康供體血清（HD-EXO）分離外泌體。
  • 輕鬆解鎖外泌體RNA生物標誌物的研究策略
    >  在當下這種高負荷的科研工作環境下，或許您需要的是一劑輕鬆又不失嚴謹的良藥，近年來外泌體（exosome）越來越受到醫學研究人員的重視，被認為是疾病標誌物早期診斷或監測的潛在新途徑，對於循環外泌體RNA（尤其是miRNA），已經成為檢測早期癌症的最具前景的生物標誌物之一，而lncRNA作為當下的另一個研究熱點，尚不確定血漿中腫瘤細胞來源的外泌體lncRNA
  • 外泌體正式進入臨床檢驗,路還有多遠?
    2015年6月24日美國德克薩斯大學安德森癌症中心研究團隊通過大量胰腺癌患者血清標本分析發現，早期胰腺癌患者血清中GPC1(glypican-1)陽性的外泌體豐度顯著高於正常人群及慢性胰腺炎患者，可以作為一種非侵入性診斷和篩查處於適合手術治療階段的早期胰腺癌的標誌物。
  • 外泌體miRNA用於肺癌早期診斷
    隨著精準醫學概念的提出，越來越多的人開始關注如何能做到疾病的精確診斷和治療。外泌體作為一個新型的研究熱點，已經成為了疾病診斷的潛在有效方式，在精準醫學發展上有著光明的前景。
  • 數據不夠?生信分析幫你湊!學會深度挖掘快速發文章
    這個時候需要的是生信分析——深度的數據挖掘和分析處理，可以幫助臨床醫生不耗費大量的時間通過實驗攢數據，而是通過數據處理得到自己想要的信息，更快速地發文章。 學習哪種生信分析的工具？
  • 重磅綜述:RNA生物標誌物——癌症精準醫療的前沿
    基於高通量測序技術，累計數據顯示多種RNA分子能夠作為多種疾病的診斷和預後生物標誌物，比如說癌症。特別是在多種生物流體（如血清、唾液和尿液）中可檢出的外泌體RNA（exRNAs），能夠作為早期癌症診斷、腫瘤發展監控、預測治療反應的無創生物標誌物。
  • 真的有必要發一大堆meta分析或者純生信數據挖掘SCI嗎?
    本文來源於微信公眾號SCI狂人，版權歸SCI狂人團隊所有，更多資料可以關注微信公眾號SCI狂人很多科研人在簡歷上都會寫上以第一作者身份發表SCI多少篇，累計影響因子達到多少，被引用了多少次等內容。有些人掌握了meta分析或者純生信數據挖掘這些技能後，可以在短時間內搞出很多篇SCI。我們之前教過的或者認識的研究生，有好幾個人都發了十幾篇meta分析、生信數據挖掘，有的博士甚至發了30多篇meta分析，有部分都是發在四大神刊上。上面這種情況往往都會被圈內認為是「灌水行為」，沒有太大的研究意義。
  • PCR ARRAY檢測外泌體發現分子標記物lncRNA PRINS
    ：對新診斷的多發性骨髓瘤（MM）患者和單克隆丙種球蛋白病（MGUS）患者的外周血外泌體中的lncRNA表達譜進行了兩期生物標誌物研究，並與健康供體（HD）進行比較。研究重點是篩選MG潛在診斷標誌物的循環lncRNA。方法1 —從病人血清中分離出外泌體2 —應用qPCR ARRAY技術篩選、驗證候選lncRNA3 —螢光原位雜交分析表1.HD、MM和MGUS患者的基線特徵
  • Cell:糖尿病研究新突破!脂肪組織巨噬細胞分泌的外泌體能夠調節...
    論文通信作者、加州大學聖地牙哥分校醫學院內分泌新陳代謝內科醫學教授Jerrold Olefsky博士說，「當外泌體在組織之間遷移時，它們誘導的反應可能是導致糖尿病中的代謝錯亂的細胞間通信的一種根本原因。通過對細胞進行螢光標記，我們能夠觀察到外泌體和它們攜帶的微RNA（microRNA, miRNA）從脂肪組織經過血液，滲透到肌肉組織和肝組織中。」
  • 膠質母細胞瘤的生物標誌物研究進展
    深入了解GBM的生物標誌物將有助於GBM的診斷、預後和預測，本文對其研究現狀及進展綜述如下。儘管如此，EGFR仍是有吸引力的分子靶點，目前正在進行的臨床試驗中，新型EGFR抑制劑對突變型GBM具有更強效、更特異性的作用，可為臨床帶來基於作用機制的聯合治療。
  • 外泌體在口腔疾病中的研究進展
    近年來，研究發現外泌體與口腔疾病也存在密切聯繫，本文就外泌體在口腔疾病中的研究進展作一簡要綜述。，同時外泌體可進行大規模工業化生產，這為將來治療口腔癌提供了新的方法。Jia等學者研究表明，外泌體的miRNA表達可區分輕微的和極為嚴重的手足口病。通過對比輕微和嚴重的手足口患者可發現，3種miRNA（miR-671-5p，miR-16-5p，miR-150-3p）的表達水平有顯著差異，表明手足口病在不同的條件下外泌體中的miRNA表達獨特的miRNA特徵；外泌體的miRNA表達譜可能為診斷和分型手足口病提供生物標誌物的鑑定。
  • 乾貨|高效化學同位素標記液相色譜質譜法用於外泌體代謝組學分析
    在體液（如血清）中的循環外泌體作為癌症診斷和監測的化學生物標誌物正在被積極關注。儘管核酸分析是發現外泌體中生物標誌物的主要工具，但代謝組學具有簡易且快速檢測的優勢，因此有擴展生物標誌物的化學多樣性的潛力。然而只能從患者少量血液中分離出痕量的外泌體，因此需要開發非常靈敏的外泌體的代謝組學分析技術。
  • Frontiers社論:生物標誌物革命——腦衰老標誌物最新總結
    為了促進健康的衰老並進一步延長無障礙生活年限（healthspan），有必要深入研究衰老的生物學機制並弄清其機理。在探索腦衰老的生理與病理界限過程中，當前的「生物標誌物革命」在醫學研究和實踐領域方面發揮了重要作用。
  • 蛋白質修飾組學促進腫瘤標誌物研究——腫瘤標誌物大會成功召開
    2017年10月12—14日全國腫瘤標誌物大會在古城西安成功舉辦。
  • 小身材,大作用——外泌體的臨床應用前景
    外泌體廣泛存在於體液中，如血清、唾液、乳汁、腦脊液、尿液和精液等體液中。其生物學功能雖然還未完全解析清楚，但科學家們在許多領域均已對其展開了研究。   外泌體主要經細胞核內體途徑生成，在進入外環境後，可通過自分泌或旁分泌途徑被細胞吸收，也可經循環系統被遠距離靶組織或器官所吸收。而且，不同細胞來源外泌體表面可攜帶相似的保守蛋白，這些蛋白可作為外泌體標誌物對其進行分析和鑑定。
  • 外泌體可能是癌症播散的種子
    腫瘤細胞分泌的外泌體攜帶一系列具有腫瘤細胞特性的成分，包括癌基因病毒源性分子、致病性遺傳物質以及蛋白成分等。外泌體通過上述分子以不同的途徑參與到針對腫瘤細胞的預防、腫瘤細胞破壞正常人體細胞與化療耐藥的過程中。用多種手段協助腫瘤逃逸外泌體是如何幫助腫瘤細胞進行侵襲和轉移的呢？首先，外泌體可以在局部和遠處的轉移位點形成有利於腫瘤細胞擴散的環境。
  • Oncomine數據挖掘快速發文捷徑
    但是現在不一樣了，現在進入了數據大時代，特別是生物信息學方面的數據，資料庫越來越多，像GEO，TCGA，Oncomine。雖然專業搞生信都要會編程，當然GEO，TCGA也離不開編程，但是這裡有一個資料庫不用編程的，這個資料庫是Oncomine，差異表達分析，共表達分析，Outlier分析等等Oncomine自己都會分析，不用任何代碼，我們只要會點滑鼠就可以了。接下讓我們一起看一下到底是怎麼樣操作？