文獻精讀:結合生信數據,挖掘外泌體研究套路

2021-01-10 網易

　　今天跟大家解讀一篇外泌體相關的文獻，這篇文章同樣綜合了多個熱點，包括幹細胞、外泌體、小分子 RNA 和生信分析，是一篇非常適合學習的參考文獻。

　　這篇是 2019 年發表在Molecular Therapy Nucleic Acids（IF：5.919）上題為《Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal MicroRNA-126-3p Inhibits Pancreatic Cancer Development by Targeting ADAM9》的文章。

　　

　　研究背景

　　主要交待了幾個方面的內容：

　　

　　胰腺癌的背景

　　

　　骨髓間充質幹細胞 (BMSCs) 在胰腺癌治療中的潛力；

　　

　　BMSCs 來源的外泌體攜帶的 miRNA 在腫瘤中的作用；

　　

　　miR- 126 - 3p 在腫瘤中的作用；

　　

　　本研究的目的主要是研究 BMSCs 來源外泌體攜帶的 miR- 126 - 3p 在胰腺癌中的作用。

　　

　　

　　研究方法

　　作者首先是進行了 GEO 資料庫挖掘篩選差異基因，利用 miRNA 靶基因預測網站預測靶基因。

　　然後在體外培養了胰腺癌細胞，並收集了 28 個胰腺癌患者的組織和 32 個胰腺炎患者的組織樣本。通過質粒慢病毒轉染胰腺癌細胞分別過表達或沉默 miR-126-3p、沉默 ADAM9，用雙螢光素酶報告試驗驗證 miR-126-3p 和 ADAM9 的關係，做了 Edu 染色和 Transwell 遷移試驗檢測胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

　　在體外培養 BMSCs，提取外泌體並進行電鏡觀察、NTA 分析和乙醯膽鹼酯酶活性檢測（AChE）。將胰腺癌細胞和 BMSCs 共培養，共聚焦顯微鏡觀察，PCR 和 Western-blot 檢測相關 RNA 和蛋白表達。

　　最後做了動物實驗，進行 BMSCs 裸鼠體內移植。

　　研究結果

　　1. 生信數據挖掘發現 ADAM9 是 miR-126-3p 的靶基因

　　主要是分析了 GEO 資料庫中的胰腺癌基因表達譜，做了韋恩圖，用 R 軟體 limma 包分析得到了 GEO 樣本共有的差異表達基因 ADAM9, 然後通過 5 個 miRNA 靶基因預測網站（TargetScan , miRSearch, miRTarBase, miRWalk ,mirDIP；這幾個網站的網址文中都作了註明）預測了 miRNA 的靶基因，發現 ADAM9 是 miR- 126 - 3p 的靶基因，用了 GEPIA 平臺分析 ADAM9 基因表達和胰腺癌患者生存率之間的相關性

　　

　　

　　2. 胰腺癌組織中 miR- 126 - 3p 的表達是下降的。

　　主要是用 PCR 檢測了胰腺癌細胞和組織中 miR- 126 - 3p 的表達。

　　

　　3. 過表達 miR- 126 - 3p 能抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進代謝。

　　這裡面主要是分了 4 個組，miR-126-3p 過表達組和對照組、miR-126 -3p 沉默組和對照組，Edu 檢測增殖、Transwell 試驗檢測遷移和侵襲, 流式細胞術檢測凋亡率。

　　

　　4. 雙螢光素酶報告試驗、PCR 和 WB 驗證了 ADAM9 是 miR- 126 - 3p 的直接靶基因。

　　主要通過沉默或過表達胰腺癌細胞中的 miR- 126 - 3p，檢測 ADAM9 的表達變化。

　　

　　5. 發現 miR- 126 - 3p 是通過負調控 ADAM9 抑制胰腺癌細胞的生物學功能。

　　分了 4 個組，空白轉染組、miR- 126 - 3p 抑制劑+空白轉染組、ADAM9 轉染沉默組、miR- 126 - 3p 抑制劑+ADAM9 轉染沉默組，檢測了胰腺癌的細胞代謝、增殖、遷移和侵襲功能。

　　

　　6. BMSCs 的培養和鑑定。

　　

　　7. 證明了 BMSCs 來源的外泌體攜帶了 miR- 126 - 3p。

　　包括了外泌體的提取和鑑定（電鏡觀察、NTA 分析和 WB 檢測標記物）；通過轉染過表達 BMSCs 中 miR- 126 - 3p 並進行紅色螢光標記，然後與 pCDNA3.1 -GFP 螢光轉染標記的胰腺癌細胞共培養，在共聚焦顯微鏡下能觀察到胰腺癌細胞中有紅色標記的 miR- 126 - 3p，用 PCR 檢測了 BMSCs、外泌體和胰腺癌細胞中 miR- 126 - 3p 的表達，並用 PCR 和 WB 檢測了胰腺癌細胞中 ADAM9 的表達。

　　

　　8. 外泌體釋放抑制劑 GW4869 通過抑制 BMSCs 外泌體的釋放（通過 AChE 檢測）抑制了胰腺癌細胞中 miR-126-3p 的表達，促進了胰腺癌細胞的遷移和侵襲。

　　

　　9. BMSCs 來源外泌體通過傳遞 miR-126-3p 影響胰腺癌細胞生物學功能。

　　通過過表達 BMSCs 中的 miR- 126 - 3p, 然後與胰腺癌細胞共培養，通過 Edu 檢測增殖、流式細胞術檢測凋亡率、Transwell 試驗檢測遷移和侵襲、WB 檢測細胞增殖和侵襲因子（MMP- 14、COX2、VEGF、Ki67）等方法檢測胰腺癌細胞的功能變化。

　　

　　10. 過表達 miR- 126 - 3p 抑制了胰腺癌的腫瘤增長和代謝。

　　這部分就是動物體內試驗，把經過 miR- 126 - 3p 過表達處理的 BMSCs 移植到裸鼠體內，檢測腫瘤的組織變化和相關因子（ADAM9、MMP- 14、COX2）的表達。

　　

　　11. 研究結果總結。

　　作者最後畫了一個漂亮的機製圖來展示本研究的結果。

　　

　　結果總結

　　本研究表明，BMSCs 來源的外泌體可以通過傳遞 miR-126-3p 靶向抑制 ADAM9 的表達，從而抑制胰腺癌的進展。

　　從這篇文章來看，重點要學習的幾個點：

　　1. 生信數據挖掘分析

　　GEO 數據挖掘找差異基因，韋恩圖製作，limma R 包分析差異基因，5 個 miRNA 靶基因預測網站。

　　2. 雙螢光素酶報告試驗

　　確定 miRNA 和預測的靶基因之間的直接關係

　　3. 細胞共培養技術

　　BMSCs 與疾病細胞的共培養

　　4. 外泌體釋放抑制的方法，可以用抑制劑 GW4869 抑制細胞外泌體的釋放。

　　5. 外泌體傳遞 miRNA 的研究套路

　　BMSCs 中的 miRNA 沉默與過表達，目的細胞靶基因的轉染沉默。

　　6. 機制模式圖的繪製

　　
一張圖總結研究結果，可以給你的文章加分很多。

　　另外，這篇文章如果凝練成基金課題，可以用下面的題目：

　　BMSCs 外泌體傳遞 miR- 126 - 3p 靶向調控 ADAM9 抑制胰腺癌進展的機制研究

　　如果想做大一點可以把 ADAM9 去掉，變成下面的題目：

　　BMSCs 外泌體傳遞 miR- 126 - 3p 抑制胰腺癌進展的機制研究

　　本文來源：逍遙君自習室

　　封面來源：站酷海洛 Plus

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