作者：王娟，駱瑜，彭友儉，武漢大學人民醫院口腔科
外泌體（exosomes）是一類直徑大小介於40～100nm的膜性脂類囊泡，它含有多種具有生物活性的RNA、miRNA、DNA和蛋白等，是細胞之間發生信號傳導的重要介質。外泌體可以由大多數細胞（如上皮細胞、腫瘤細胞、間充質幹細胞、免疫細胞等）分泌，也廣泛存在於唾液、尿液、血液、腦脊液、乳汁等體液中。
外泌體已經被發現在腫瘤疾病中具有抗腫瘤免疫、早期診斷等作用，對組織（如心、肝、腦、腎等）損傷也有修復作用。近年來，研究發現外泌體與口腔疾病也存在密切聯繫，本文就外泌體在口腔疾病中的研究進展作一簡要綜述。
1.外泌體的形成
外泌體的形成，首先是由分泌細胞的細胞膜向內凹陷，並在高爾基複合體的加工下形成早期核內體，然後包裹胞漿內的miRNA、mRNA及DNA等形成成熟核內體，然後在粗面內質網和高爾基複合體的加工下形成多囊泡體（multivesicular body，MVB），一部分MVB被細胞溶酶體降解，一部分MVB與細胞膜融合，通過胞吐方式向細胞外釋放即外泌體。
外泌體的組成主要包括細胞膜融合蛋白和轉運相關蛋白，如Annexin和Rab蛋白；熱休克蛋白，如Hsp70、Hsp84和Hsp90等；信號轉導蛋白，如蛋白激酶、異源三聚體G蛋白；以及含有可與包括MHC分子和整合素等多種蛋白質相互作用的四分子交聯體超家族，如CD63、CD9、CD81等。
2.外泌體的生物學功能
外泌體的生物學功能與其來源的母體細胞密切相關，不同來源的細胞其功能不同，主要特徵性功能如下。
2.1清除細胞成熟過程中的代謝蛋白
外泌體最早被認為是細胞代謝的「垃圾」，後來被發現在紅細胞成熟過程中可以清除多餘的轉鐵蛋白受體和乙醯膽鹼酯酶。研究顯示紅細胞在成熟過程中向外環境釋放外泌體，外泌體中轉鐵蛋白受體與熱休克蛋白HSP70相互作用，從而使轉鐵蛋白受體從紅細胞表面消失。
2.2介導細胞間的信息交流
不同細胞釋放的外泌體大部分均攜帶豐富的母體細胞膜表面蛋白，能與不同的細胞膜表面受體配對，在細胞之間沒有直接接觸的情況下，通過膜表面的受體－配體高效率的結合，進行細胞間的信號傳導。例如樹突狀細胞來源的外泌體，通過其膜表面的蛋白複合物（如熱休克蛋白、四跨膜蛋白等）與靶細胞膜表面的相應受體進行相互作用，從而觸發了T淋巴細胞的免疫活性。另外，外泌體也可以將所攜帶的具有生物活性的蛋白質及RNA、miRNA等通過直接與靶細胞細胞膜融合後釋放到靶細胞內，參與細胞的調控。此外，外泌體亦可以通過胞吞的方式整體進入靶細胞內，從而進行細胞間的信息傳遞。
2.3免疫耐受
外泌體由於體積小不易被機體免疫細胞識別和清除，從而呈現出低免疫狀態。如樹突狀細胞是免疫系統中的重要細胞，研究表明由未成熟的樹突狀細胞釋放的外泌體，被認為是介導自身免疫耐受的重要中介之一。研究發現在大鼠骨髓移植前7d或14d，將供體骨髓中樹突狀細胞產生的外泌體注射給受體，可以顯著延長異體移植的大鼠心臟存活時間。此外，體外實驗也觀察到接受外泌體治療的受體內CD4+T細胞顯著減少，該結果說明了免疫耐受現象的存在。
2.4靶向性
外泌體與靶細胞的受體－配體高效率結合有助於外泌體的遠距離運輸，外泌體可作為靶向藥物輸送系統使用。外泌體作為藥物的天然內源性載體具有獨特的優勢，如其免疫原性低、穩定性高、向細胞運輸的效率高、有更強的增強滲透滯留效應等。然而，不同類型細胞分泌的外泌體特點也有不同，例如相比於其他分泌細胞，樹突狀細胞分泌的外泌體表面會表達CD9，這種蛋白有利於加強外泌體與靶細胞的融合從而提高外泌體對藥物運輸的效率。
3.外泌體在口腔疾病中的相關研究
口腔疾病主要包括牙體、牙周、口腔頜面外科和口腔黏膜病等，診斷和治療方法繁多，但是各有利弊。因此，探索新的診斷技術和治療方法一直是口腔醫學研究人員關注的熱點。外泌體在口腔疾病的研究中從最初主要集中在口腔腫瘤和自身免疫性口腔黏膜疾病，到現在已經擴展到口腔上皮間充質轉化、牙周免疫和口腔組織再生等方面，這說明外泌體在口腔領域的潛在應用價值正在被引起重視。
3.1口腔腫瘤
口腔癌患者佔全世界所有癌症病例的2%～4%，其中男性的發病率和死亡率（分別為2.3%和1.7%）高於女性（1.2%和0.8%）。口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔癌中最常見的口腔腫瘤。研究發現在早期被檢測治療的口腔鱗狀細胞癌5年生存率可以達到60%～80%。目前，臨床對腫瘤的診斷主要靠病理診斷，有些早期還未形成臨床診斷的病變很難被及時診斷。因此，早期診斷OSCC是很有臨床意義的。
Zlotogorski-Hurvitz等學者分別從口腔癌患者和健康個體中分離出唾液來源的外泌體，通過比較它們的形態、分子間差異，發現口腔癌患者唾液中分離的外泌體四跨膜蛋白（CD63、CD9和CD81）的表達與健康個體存在明顯差異，CD81和CD9下降，CD63上升，這種差異提示外泌體可作為早期診斷的標誌物。同時，唾液中外泌體的獲取相比傳統病理組織取材是簡單無損害的，唾液中的外泌體標記物檢測可能對臨床上不能鑑別的早期腫瘤進行診斷。研究統計經過治療的OSCC患者的復發率，結果顯示腫瘤復發率為15%～33%，並且腫瘤病人的復發治療難度相比初次治療要大。因此，有必要預測哪些OSCC病人是最有風險復發的，但是臨床上目前尚無比較理想的預測手段。
Hou等學者研究發現腫瘤衍生的外泌體增加了腺樣囊性癌細胞的遷移和侵襲能力，而腺樣囊性癌細胞株SACC-83衍生的外泌體被宿主細胞吸收，增強了內皮細胞的滲透性，還證明了細胞連接相關蛋白（claudins和ZO-1）的表達是下調的，這可能與腫瘤衍生的外泌體介導的侵襲、轉移有關。唾液腺的上皮－間質相互作用主要由生長因子和細胞外基質調控，Hayashi等學者發現含有間質特異性成熟miRNA的外泌體，可為間質到上皮的轉化提供遺傳信號，成熟的間質中的mir-133b-3p可通過外泌體從間質轉移至上皮細胞中，從而確認了miRNA的失調是體內癌細胞擴散的特徵標誌。
由此可見，外泌體在腫瘤的復發轉移中可能發揮作用，這提示腫瘤細胞來源的外泌體有望成為腫瘤病情監測、療效評估的新型生物標誌物，其脂質雙分子層膜結構對其內容物起到了很好的保護作用，可防止內容物被血液循環中酶類物質降解，從而具有更高的穩定性，且外泌體體積較小，通透體內組織屏障能力較強，更易到達各種體液，為液體活檢提供了重要的前提。
唾液是一種簡單易獲取的生物液體，不同外泌體中miRNA的組成不同，可用於製造出特定疾病的唾液生物標誌物，便於疾病的監測。口腔惡性腫瘤目前最主要的治療方法是手術、放療和化療，但是手術治療會對吞咽、言語和外貌有顯著影響，極大地影響了病人的生活質量，放、化療的副作用也極大影響患者的身心健康。
口腔腫瘤免疫治療是目前比較理想的抗腫瘤新療法，李金等學者的研究發現舌癌Tca8113細胞能分泌外泌體，從Tca8113細胞中分離並純化外泌體，通過透射電子顯微鏡觀察其超微結構，蛋白質印跡法分析其表面成分，發現Tca8113細胞分泌的外泌體攜帶有腫瘤抗原，其內含有多種與腫瘤免疫相關的蛋白具有抗腫瘤作用；腫瘤來源的外泌體正在形成抗腫瘤免疫調節劑，同時外泌體可進行大規模工業化生產，這為將來治療口腔癌提供了新的方法。
3.2牙周病
牙周病是人類口腔常見疾病之一，是一種慢性炎症性疾病。菌斑微生物及其產物的侵襲是牙周病的始動因子，研究已經證實口腔中有30餘種細菌與牙周病的發生和發展有關，包括牙齦卟啉單胞菌、伴放線菌嗜血菌、具核梭桿菌等。細菌也可以分泌外泌體，研究發現牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體可以抑制牙齦成纖維細胞和人臍靜脈內皮細胞的增殖，同時抑制了人臍靜脈內皮細胞毛細血管的形成，這提示外泌體可以通過影響牙周組織中的細胞增殖和血管形成來促進牙周炎的進展。
在慢性牙周炎中，細胞之間信號分子的傳遞可能是局部炎症和全身炎症的重要來源，可能導致牙周易感細胞不需要細胞接觸就可以始終暴露在相對高濃度的毒素中，從而引起牙周病。NOD1和NOD2被證明是細菌感染的關鍵細胞內傳感器，通過激活核因子NF-κB誘導免疫應答和消除細菌。NOD1和NOD2在口腔組織中各種細胞類型（如牙齦成纖維細胞、牙周韌帶細胞等）中表達。
研究發現A型伴放線桿菌的來源的外泌體可以被人類細胞攝取，並傳遞部分激活NOD1和NOD2的抗原，有助於細菌外囊泡誘導的整體炎症反應。同時，miRNA是真核生物基因表達的主要調節者，有研究從牙齦卟啉單胞菌、伴放線桿菌等細菌中分離了miRNA，並且這些miRNA可通過外泌體被傳遞到真核生物，這提示外泌體可以參與介導細菌與人之間的相互作用，為牙周致病機制提供新的見解。
3.3口腔黏膜相關疾病
口腔扁平苔蘚是一種伴有慢性淺表性炎症的皮膚－黏膜角化異常性疾病，是口腔黏膜病中一種常見疾病，其確切病因不明。其主要臨床分型主要分為斑紋型和萎縮糜爛型兩種，世界衛生組織已經將口腔扁平苔蘚列為癌前病變，尤其是萎縮糜爛型的患者經過治療仍然經久不愈，應提高警惕。因此，對口腔扁平苔蘚應該正確診斷和治療，並對病例進行定期檢測做到癌變的早發現、早治療。
Byun等通過比較16名口腔扁平苔蘚患者和8名健康對照者的唾液miRNA譜，發現miR-4484在口腔扁平苔蘚患者的外泌體中顯著升高，這提示唾液中的外泌體攜帶的miRNA可能是口腔扁平苔蘚的特異性生物標誌。手足口病是一種兒童傳染性疾病，又被稱為是皰疹性水皰性口腔炎，以手、足和口腔黏膜皰疹或破潰後形成潰瘍為主要的臨床表現。Jia等學者研究表明，外泌體的miRNA表達可區分輕微的和極為嚴重的手足口病。通過對比輕微和嚴重的手足口患者可發現，3種miRNA（miR-671-5p，miR-16-5p，miR-150-3p）的表達水平有顯著差異，表明手足口病在不同的條件下外泌體中的miRNA表達獨特的miRNA特徵；外泌體的miRNA表達譜可能為診斷和分型手足口病提供生物標誌物的鑑定。
3.4口腔組織再生
口腔牙髓疾病的傳統治療方法是以生物材料替代有活力的牙髓組織，牙髓組織再生一直是學者們關注和研究的熱點，幹細胞作為種子細胞已獲得廣泛認同，誘導幹細胞分化為牙髓組織是一個亟待解決的問題。特異性外泌體可引發幹細胞的家系分化，Huang等學者評估了來自牙髓幹細胞的外泌體誘導人牙髓幹細胞的分化和人類骨髓基質細胞的衍生，結果發現外泌體可與基質蛋白結合，實驗表明外泌體觸發了牙髓樣組織再生，在牙源性條件下分離的外泌體能更好地誘導幹細胞分化和組織再生。
另外，有學者分別用普通培養基和成牙本質細胞培養基培養牙髓幹細胞（dental pulp stem cells，DPSCs），分別提取培養液中的外泌體，然後將其接種於Ⅰ型膠原膜上形成複合物，再將複合物置於牙根片段內，最後將牙根片段複合物置於裸鼠背部皮下，免疫組化顯示實驗組成牙本質誘導後DPSCs分泌的外泌體組高表達基質礦化和細胞成牙本質分化的關鍵調節因子DMP1和DPP。這提示外泌體或其傳遞的分子可能是治療口腔疾病或牙體組織再生的介入靶點。
3.5口腔來源的外泌體與全身疾病
外泌體可以來源於口腔唾液、細胞以及細菌等，有研究顯示口腔來源的外泌體與遠端疾病有密切聯繫。例如阿爾茨海默病是一種神經退行性病變，目前臨床治療主要以延緩神經退化速度為主。Jarmalaviciute等從人類脫落的乳牙牙髓中提取的幹細胞具有神經基因特性，乳牙牙髓幹細胞旁分泌對神經再生的重要性已得到認可，但其確切機制尚不清楚，研究表明乳牙牙髓幹細胞來源的外泌體可在多巴胺神經元上抑制由6-羥基多巴胺誘導的神經元凋亡，由此表明，從乳牙牙髓幹細胞中提取的外泌體可能成為治療帕金森病的新手段。此外，有研究發現乳腺癌細胞分泌的外泌體可以被口腔唾液腺細胞攝取，改變唾液腺細胞的轉錄機制，從而改變唾液腺分泌的外泌體的成分，這提示通過檢測唾液中外泌體的成分，可以對乳腺癌進行診斷。
4.展望
外泌體是細胞衍生的囊泡，不同細胞來源的外泌體所含的成分不同，可以作為「精準醫學」的潛在診斷生物標誌物，有利於疾病的早期診斷。外泌體具有抗腫瘤免疫、促進血管新生、促進組織再生等功能，有助於臨床上對口腔疾病的早期診斷、治療以及促進口腔組織再生等。儘管外泌體在口腔疾病中已經引起學者們的關注，但是尚處於起步階段仍然需要進一步探索研究。口腔唾液作為一種易獲取的生物體液，如果未來能徹底透徹研究唾液中外泌體的信息，充分利用唾液來源的外泌體對全身疾病和口腔疾病進行診斷，並且有針對性的利用外泌體進行疾病治療，這將為臨床診斷和治療提供新思路。
來源：王娟,駱瑜,彭友儉.外泌體在口腔疾病中的研究進展[J].口腔醫學,2019,39(10):952-956.
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