一、液體活檢的概念
通過檢測腫瘤原發或轉移部位釋放到血液中的循環腫瘤細胞（CTC）、循環腫瘤DNA（ctDNA）或其他標記物（如外泌體）對疾病進行診斷和評價的技術稱為液體活檢。目前多通過檢測腫瘤標誌性的DNA序列或腫瘤相關RNA 的表達變異進行分析。
CTC指由腫瘤原發或轉移部位釋放到外周血循環中的游離腫瘤細胞，為包含DNA、RNA和蛋白等的完整細胞結構，比ctDNA能提供更加豐富的腫瘤相關信息。循環遊離DNA（cfDNA）指血漿或血清中由健康、炎性和腫瘤組織細胞凋亡或壞死後釋放產生的游離DNA 的總和，多以約200bp的雙鏈DNA碎片的形式存在。最新的研究發現通過對cfDNA 的片段譜系進行分析，構制核小體的全基因組圖譜，與多種細胞的死亡和生理條件進行對比，可以幫助鑑別cfDNA的組織起源。ctDNA指來源於腫瘤細胞的cfDNA，為cfDNA的一部分。cfDNA或ctDNA在血漿、尿液及其他體液中以多種形式存在，如游離DNA片段、核小體、外泌體、病毒體等，其中外泌體是細胞主動向胞外分泌的一種囊泡樣小體，多項研究表明外泌體參與腫瘤的進展和轉移。
二、液體活檢的實現基礎和應用現狀
液體活檢是近年來實體腫瘤研究和臨床應用中的重要技術進展。早期研究發現，腫瘤患者中平均CTC或ctDNA 的水平高於健康對照，尤其在轉移性腫瘤患者中更高。轉移性實體瘤外周血中平均CTC的數量為60 ± 6. 93/7. 5 ml。在不同類型和分期的腫瘤中，CTC或ctDNA的水平亦不同。之後研究發現，CTC或ctDNA 攜帶與原發腫瘤組織中相同的分子異常，為實體腫瘤的監測提供了很好的腫瘤標記物。但長期以來受微量CTC細胞分離和低比例ctDNA基因突變檢測技術的限制，實體腫瘤的研究仍主要依賴於組織活檢和影像學檢查。隨著高量基因測序技術的進展和腫瘤基因組研究的深入，越來越多的腫瘤診斷和治療相關的基因變異被鑑定，並使得從外周血cfDNA中進行全基因組規模的測序分析或檢測腫瘤相關的基因突變成為可能很多研究結果表明，液體活檢在多種實體瘤的基因分型、療效評價、復發和耐藥監測中具有潛在的應用價值，如研究已明確外周血中CTC數量與轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌患者的無進展生存和總生存相關。
相應的CTC檢測系統Cell SeaRch也已被FDA批准用於這3種實體腫瘤的預後評估中。Bettegowda等報導，ctDNA對轉移性結腸癌患者KRAS突變的檢測靈敏度和特異性分別為87.2%和99.2%，並在96%的EGFR抑制劑治療失敗的患者ctDNA中檢測到耐藥突變。
三、液體活檢在淋巴瘤中的研究和應用進展
淋巴瘤是一組起源於外周淋巴組織的異質性的惡性血液腫瘤，根據所起源的細胞類型和組織結構的病理變化不同分為多種亞型，其預後因不同細胞起源、病理類型及侵襲性而不同。淋巴瘤雖屬於具有組織結構的實體腫瘤，但與其他實體腫瘤相比，具有更易浸潤骨髓、腫瘤細胞更易進入外周血循環的特點。除少數腫瘤特異性的基因突變外，目前多數淋巴瘤亞型並沒有特異的腫瘤標記物，但理論上絕大多數B或T 細胞淋巴瘤都有特徵性的免疫球蛋白（IG）或T細胞受體（TCR）重排序列可作為腫瘤監測的分子指標。因此，液體活檢技術在淋巴瘤的輔助診斷和MRD 監測等應用中，具有不同於其他實體腫瘤的特點和優勢。
淋巴瘤中cfDNA 的含量
研究發現不同淋巴瘤亞型中cfDNA 的水平變異較大，其中初診瀰漫大B 細胞淋巴瘤（ DLBCL）、霍奇金淋巴瘤（HL）和套細胞淋巴瘤亞型中cfDNA的濃度顯著高於健康對照（中位數12.1 ng /ml），分別為26.9、25.7 和23.1 ng /ml，而濾泡淋巴瘤中cfDNA的水平較低（ 中位14.7 ng /ml）。在另一項兒童初診淋巴瘤的研究中，同樣發現有多種淋巴瘤的cfDNA 濃度（中位46 ng /ml）顯著高於健康對照（ 中位1. 6 ng /ml）。不同淋巴瘤分期患者的cfDNA 水平也存在顯著差異。Roschewski等報導早期DLBCL患者的中位cfDNA濃度顯著低於進展期。
液體活檢在淋巴瘤臨床應用中的價值
輔助診斷和基因分型
基於二代測序（NGS）技術，ctDNA檢測相關基因變異和IG/TCR克隆性重排序列可用於淋巴瘤患者的基因分型。ScheReR等對初診DLBCL患者的ctDNA進行268 種相關基因的NGS 測序（CAPP- Seq），結果顯示97%（n = 37）的ctDNA樣本對原發活檢樣本中突變的檢測特異性為99. 3%，對單核苷酸變異和融合基因的中位重複率大於85%。Rasi等用超深度測序對17例初診DLBCL患者的cfDNA進行59種相關基因的突變分析，結果顯示cfDNA對原發活檢樣本中突變頻率＞ 15% 的基因突變的檢測敏感性達到92%。在除DLBCL外的部分其他淋巴瘤亞型中，ctDNA也顯示出良好的基因分型作用。
每個B細胞都有其特異的IG重排序列，T細胞有其特異的TCR重排序列。基於此原理， IG/TCR的重排克隆性檢測能夠在一定程度上指導對B /T細胞克隆性的判斷。早期已有研究發現在B細胞腫瘤的血漿或血清DNA 中能檢測到IG克隆性重排。ARmand 等報導，在69%（11 /16）的初診DLBCL和縱膈大B細胞淋巴瘤患者的ctDNA中檢測到與原發腫瘤組織中克隆型一致的基因序列。KuRtz等報導，在82%的初治和100%的復發DLBCL患者的cfDNA中檢測到與原發腫瘤組織克隆型相同的基因序列。這些研究顯示，通過結合NGS技術，ctDNA作為一種IG/TCR克隆重排標記物能夠監測原發腫瘤組織中的克隆型，可用於輔助淋巴瘤的診斷和MRD監測。
液體活檢在淋巴瘤的基因分型中具有潛在的應用價值，但對不同突變類型的檢測靈敏度，以及在不同淋巴瘤亞型中的應用，還需進一步的研究驗證。預後和療效評價多項研究發現cfDNA水平與DLBCL患者的腫瘤負荷、IPI 評分、乳酸脫氫酶水平、疾病進展等相關。KuRtz等通過對ctDNA進行動態監測，發現ctDNA的水平變化與治療反應相關，並與影像學變化一致，而且能夠更早期預測治療失敗。對cfDNA與預後相關性的研究發現，在初診HL、DLBCL和濾泡淋巴瘤患者中，高水平的cfDNA與預後差相關。而在其他淋巴瘤亞型中，其預後意義未見報導或與不相關。Fontanilles等報導，在原發中樞神經系統的初診淋巴瘤患者中，cfDNA陽性和陰性患者之間的總生存無顯著差異。
預測復發
影像學檢查作為淋巴瘤緩解期監測的主要方法，受限於放射性和有限的檢測靈敏度，不能有效的早期發現疾病的進展和復發。而與PET /CT相比，ctDNA對預測復發具有更高的特異性。研究發現在完全緩解期的DLBCL患者中，ctDNA監測腫瘤特異性IG 重排序列陽性者較陰性者具有更高的疾病進展風險。Roschewski等報導，在緩解期動態監測ctDNA 能夠提前中位3.5個月預測DLBCL復發。ScheReR等報導，ctDNA能對90%（9/10）的DLBCL復發患者提前中位數162天預測復發。
五、結語
液體活檢作為一種非侵入性的檢測方法，在實體腫瘤的基因分型、預後和療效評價等方面均已發揮重要的臨床應用價值。而淋巴瘤的組織病理學分型複雜，其診斷一直是困擾病理學家的問題，分子生物學指標的加入將有助於淋巴瘤的更準確分型。淋巴瘤的腫瘤細胞具有更易進入外周循環系統、可通過免疫受體分子多樣性標誌進行監測的特點，使液體活檢具有更為明確的應用意義。淋巴瘤液體活檢相關的研究目前尚處於起步階段，但隨著淋巴瘤腫瘤基因組學的研究進展和NGS 技術的推廣應用，以腫瘤特異性基因突變和IG/TCR 序列多樣性分析為主要內容的液體活檢技術將成為輔助淋巴瘤基因分型和療效監測的重要補充工具。
來源：中國實驗血液學雜誌 Journal of Experimental Hematology 2017; 25( 4)
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