液體活檢技術在腫瘤早篩中的創新應用探索

腫瘤早期診斷是有效提高腫瘤預後的最重要手段之一。目前採用的影像、內鏡、腫瘤標誌物等進行腫瘤早期篩查方式的敏感性仍不夠理想。液體活檢對檢出極微量的腫瘤來源核酸等標誌物具有很高的敏感性，可應用於腫瘤早期乃至超早期篩查，未來市場潛力巨大。

一、我國腫瘤防治現狀

根據2018年《柳葉刀》上的全球腫瘤生存趨勢監測報告顯示，我國整體腫瘤5年生存率為36.0%，遠低於美國的64.0%。其中主要原因很可能是我國居民腫瘤早篩觀念較低，60%～80%的患者在確診時已到了中晚期，錯過了腫瘤治療的最佳時期。腫瘤病人生存率隨著時間的推移是逐漸下降的，如果把診斷和治療從III期推移到I、II期，那麼腫瘤的死亡率起碼可以降低一半。

2018年我國政府工作報告中提及，今後針對腫瘤發病高危人群，以及有明確證據證明通過篩查早診早治，明顯降低發病和死亡的高發癌症病種，國家將加大資金投入，在醫保以及新農合中設立專項資金進行早期篩查，真正實現關口前移，預防為主。

一、液體活檢應用於腫瘤早篩的潛力和挑戰

（一）當前腫瘤篩查和診斷方式應用於腫瘤早篩存在局限性

腫瘤的篩查和診斷目前主要依靠內鏡、影像學檢測和腫瘤標誌物等手段，但普遍存在局限性，敏感度不夠理想。內鏡往往為侵入式操作，對病人體質要求較高；影像學手段通常具有輻射性，且對早期腫瘤的識別力較低；腫瘤標記物方法是測量腫瘤組織在生長過程中分泌、排出到血液中的蛋白質含量，但該方法的假陽性和假陰性的概率均較高。

（二）液體活檢有望實現腫瘤早期檢測，市場容量巨大，但敏感性和特異性有待提高

研究表明，在影像檢驗顯示出明顯的腫瘤發病跡象前，早期患者血液中可能已經出現CTC、ctDNA，也就是說通過CTC檢測和ctDNA檢測可能實現腫瘤早篩。

液體活檢採用高通量測序、PCR等手段,對檢出極微量的腫瘤來源核酸等標誌物具有很高的敏感性，因此可以用於腫瘤的早期乃至超早期篩查。大多數液體活檢的對象是血液樣品，容易實現對多種腫瘤的同步覆蓋，從而大大提高早篩效率並降低成本。

（三）液體活檢在腫瘤早篩領域有望帶來一個潛力巨大的藍海市場

根據美國國家腫瘤中心（NCI）指南，目前僅有乳腺癌、宮頸癌和結直腸癌有NCI推薦的診斷手段，但是沒有一個液體活檢手段，其他腫瘤類型沒有NCI指南推薦的適合篩查的檢測手段。

由於臨床上極大的未滿足需求以及液體活檢技術的優越性，液體活檢在腫瘤早篩領域有望帶來一個潛力巨大的藍海市場。在2015年底的時候，JP摩根和高盛對液體活檢市場就做了相應預測，其中早篩的佔比是最大的。

圖1 不同腫瘤患者的篩查和診斷手段

（四）液體活檢存在技術局限性，其分析效度和臨床有效性有待確

雖然液體活檢在腫瘤早篩中的應用非常有前景，但是目前還沒有成熟的技術來實現這一目標。液體活檢早篩技術既需要具有高度的敏感性，用於檢測由癌前病變或早期腫瘤釋放的痕量cfDNA或其他物質；也需要具有高度的特異性，可以最大限度地減少大量未受影響的人群接受篩查時的假陽性結果。

圖2  腫瘤篩查和診斷手段的比較

二、基於液體活檢技術的腫瘤早篩檢測對象

基於液體活檢技術所衍生出來的早篩檢測對象主要包括「循環DNA」、「循環RNA」和「循環蛋白」，其中「循環DNA」佔主導，以甲基化最受青睞。

（一）「循環DNA」層面

針對「循環DNA」，一方面可以通過高通量測序技術來檢測腫瘤中特有的鹼基突變、拷貝數變異以及基因組結構變異等信息，還可以通過表觀遺傳學的相關檢測手段來發現腫瘤特有的甲基化模式、組蛋白修飾模式等。起初，cfDNA層面的液體活檢技術主要基於鹼基突變，然而其用於腫瘤早期檢測時存在一些難以迴避的挑戰。首先，由於許多腫瘤類型在一些基因如KRAS、BRAF或TP53中具有共同突變，因此在進行陽性液體活檢測試後將腫瘤定位於特定器官可能是困難的。此外，良性病變可能擁有在腫瘤中發現的相同突變，並有潛力將cfDNA排入血液循環中。cfDNA中可檢測到的突變通過「未定潛能的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential, CHIP）」過程，也可能來源於骨髓中異常且通常是良性的克隆群體。CHIP的頻率隨年齡呈指數增長，其在70歲以上的人中比率超過10%。因此，CHIP是cfDNA中可檢測到的多種突變的一種常見來源，對cfDNA突變檢測的應用構成了重大挑戰。出於這個原因，除了cfDNA中的簡單突變檢測之外，腫瘤相關的病毒序列和DNA甲基化檢測也正在被探究用於腫瘤早篩。

盧煜明教授研究團隊發現血漿樣本EBV病毒的DNA分析有助於早期無症狀鼻咽癌的篩查。隨後，他們還對EB病毒的cfDNA檢測方法進行了改進。這種改進方法可以增強陽性預測值，在鼻咽癌篩查中表現出優越的性能；同時，該方法也降低了檢測成本，可以在單一時間點抽取一次血樣，將有助於進行鼻咽癌的大規模篩查。

DNA甲基化有足夠的潛力作為腫瘤的生物標誌物，用於篩查、預後以及療效監測。在表觀遺傳中，最常見的甲基化修飾就是胞嘧啶甲基化和羥甲基化，產生5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。已有研究表明，通過血液cfDNA的5mC和5hmC檢測，找出腫瘤與非癌的差異，可以對腫瘤進行輔助診斷。

2017年3月，張鵾教授研究團隊於《自然·遺傳學》雜誌上公布了世界首創的高通量甲基化無創檢測新技術，該技術不僅可以在腫瘤早期進行檢測，而且能夠實現組織定位。隨後，張康教授和徐瑞華教授研究團隊發現通過檢測少量血液中ctDNA特定位點甲基化水平，可以對肝癌進行早期診斷及療效和預後預測。這種新方法與原來常規的甲胎蛋白檢測相比，將肝癌的漏診率降低一半以上，幫助醫生發現更多的早期肝癌患者。此外，何川教授研究團隊發現通過比較健康人和肝癌患者的5hmC在全基因組範圍DNA中的分布和含量，找出差異5hmC信號模式來作為腫瘤標誌物，可實現早期腫瘤檢測。

（二）「循環RNA」層面

理論上來講，miRNA、lncRNA、mRNA都可以作為腫瘤特異性的標記物應用在臨床。其中，mRNA在鑑定腫瘤特異性基因表達譜中最為常用，但胞外mRNA在血液中難以檢測到，主要原因是其大多數會被RNA酶快速降解。相比之下，miRNA在血液中以核酸-蛋白複合物形式存在或包被於外泌體中，不易被降解。大量研究發現，特定血清miRNA的表達高低可用於肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等常見腫瘤的早期篩查、診斷和療效跟蹤。而且，將十幾乃至數十個miRNA編為一組（即一個panel），通過一系列算法和計分機制可提高檢測的靈敏度和特異性。lncRNA是一種長度大於200個核苷酸的非編碼RNA，其在血液中也很穩定，並受內源RNA酶的保護。相比miRNA，我們目前對lncRNA的生物學特性及功能了解的還很少，但循環lncRNA未來也很可能成為用於腫瘤早期篩查及診斷的生物標誌物。

（三）「循環蛋白」層面

蛋白質組學在早期腫瘤檢測中的應用潛力已經探索了很長時間，但基於蛋白質的檢測仍未達到臨床所需的敏感度和特異性。目前，前列腺特異性抗原（PSA）是唯一廣泛應用於腫瘤早篩的腫瘤標誌物，而且其合理使用仍然處於爭論之中。除了游離形式之外，血液中的蛋白質還存在於外泌體中。例如，細胞表面糖蛋白GPC1在腫瘤細胞來源的外泌體中特異性富集，有望作為胰腺癌早期的診斷生物標識。近些年，蛋白質組學和肽組學的最新進展顯露了蛋白質未來在腫瘤液體活檢中所發揮的重要價值。

圖3  腫瘤早篩的檢測對象

未來，用於腫瘤早篩的液體活檢策略很可能會融合不同種類的檢測對象，綜合不同的技術手段。一項名為CancerSEEK的血液檢測方法通過測量16個基因的ctDNA以及8個蛋白質生物標誌物，可以用於8種腫瘤的早期檢測，而且能夠確定腫瘤起源組織。

面對腫瘤早篩，我們當前需要做的應是儘可能的尋找到腫瘤早期形成及演變的「先驗知識」即腫瘤早期時的「蛛絲馬跡」，以此為起點不斷優化。基於液體活檢的方式可能很難以100%的特異性和敏感度實現腫瘤早期檢測，也可能不存在能早期檢測所有腫瘤的液體活檢方法。

三、ctDNA甲基化的檢測技術

（一）亞硫酸氫鹽測序是DNA甲基化檢測的金標準

DNA甲基化檢測由於具有信號特異性強、定位腫瘤等優勢，目前已經得到了科研人員、企業家和投資者的青睞。當前使用的DNA甲基化檢測方法大都需要亞硫酸氫鹽處理。亞硫酸氫鈉處理後，未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而發生甲基化的胞嘧啶不變，通過甲基化特異性PCR、甲基化晶片或者測序可以檢測DNA甲基化位點。

由於血漿cfDNA的豐度低且碎片化程度高，限制了大部分血漿甲基化特異性PCR檢測方法的應用，相關檢測研究也存在較大的挑戰。基於晶片和下一代測序（NGS）的高通量技術為DNA甲基化的廣泛檢測提供了技術平臺。甲基化晶片主要有450K和850K兩款，它們基於螢光定量來鑑定DNA甲基化，和測序的結果吻合度較好，但問題在於檢測位點數較少，且現階段的成本也不便宜。由於NGS技術的快速發展，其在ctDNA的甲基化檢測中得到了廣泛應用。

根據基因組覆蓋範圍，基於NGS的甲基化檢測技術可分為覆蓋所有甲基化位點的WGBS（Whole genome bisulfite sequencing）技術，覆蓋~10%甲基化位點的RRBS（Reducedrepresentation bisulfite sequencing）技術和甲基化捕獲技術。WGBS可以覆蓋所有甲基化位點，還能夠配合靶向技術檢測低頻甲基化信號，檢測成本也最高。RRBS在亞硫酸氫鹽處理前，使用MspI（該酶的酶切位點為CCGG）酶切對樣本進行處理，去除低CG含量DNA片段，從而使用較小的數據量富集到儘可能多的包含CpG位點的DNA片段（甲基化的DNA通常富含CpG位點）。RRBS在三種NGS技術中成本最低，但測序數據不夠穩定。甲基化捕獲技術使用雜交探針富集甲基化相關片段後再測序，成本介於WGBS和RRBS之間，數據較RRBS更穩定，目前已經開發有商業化的試劑盒，如Roche SeqCap Epi CpGiant Kit。

最初的WGBS技術使用傳統的亞硫酸氫鹽處理前建庫方法（Pre-BS），然而亞硫酸氫鹽轉化會導致~90%的DNA模板丟失，從而造成建庫起始量高，有效數據量低。因此，在文庫構建流程中，目前的WGBS大都使用亞硫酸氫鹽轉化後建庫策略（Post-BS），該策略能夠有效的規避亞硫酸氫鹽處理對預文庫的損傷，提高模板利用率，降低建庫起始量，同時提高測序文庫豐富度，增加有效測序數據。不過，在Post-BS建庫時，單鏈DNA在連接接頭時的效率較低，目前已有多種方法在嘗試攻克單鏈建庫這個難題。

（二）亞硫酸氫鹽測序存在限制，BS-free技術不斷湧現

目前，亞硫酸氫鹽測序是DNA甲基化檢測的金標準。但這種測序方法仍有極大的限制，由於亞硫酸氫鹽對DNA的降解率高達84%-96%，在處理有限的樣本時（如血液中的cfDNA），亞硫酸氫鹽測序將變得非常具有挑戰性。此外，亞硫酸氫鹽測序是間接檢測5mC和5hmC。由於未修飾的胞嘧啶約佔人類基因組總胞嘧啶的95%。將所有未修飾的胞嘧啶轉換為尿嘧啶會嚴重降低序列複雜性，導致測序質量差，定位效率低，基因組覆蓋不均勻和測序成本增加。因此，無需亞硫酸氫鹽處理的甲基化檢測技術（BS-free）一直是研究者夢寐以求「神器」。

加拿大多倫多瑪格麗特公主腫瘤中心的Shu Yi Shen等研究者開發了一種名為「甲基化游離DNA免疫共沉澱測序（cfMeDIP-seq）」方法。該方法將免疫共沉澱技術與高通量測序結合，通過對cfDNA中的甲基化DNA片段進行特異性富集，提高檢測效率。同時結合機器學習構建一種分類器，能夠識別血液樣本中腫瘤來源的DNA，並確定癌種。

同年，美國賓夕法尼亞大學研究人員報導了一種利用酶學轉化原理替換亞硫酸氫鹽化學轉化的方法——ACE-seq，該方法通過引入一種被稱為APOBEC的脫氨酶，可以有效區分胞嘧啶修飾狀態，其所能達到的效果與使用亞硫酸氫鹽處理相似，但不會對DNA造成損傷。

2019年2月25日，牛津大學路德維格腫瘤研究所宋春嘯等研究者發現了一種新的DNA甲基化測序方法：TET輔助吡啶硼烷測序（TET-assisted pyridine boranesequencing，TAPS）。該方法首先利用TET酶將5mC和5hmC轉化為第三種修飾，然後再利用化學反應將其轉化為胸腺嘧啶，就可以通過普通測序儀直接測序。目前，此團隊正在改進該方法，使其用於檢測單細胞和血液中的ctDNA，以開發微創、無創的腫瘤診斷技術。

圖4  DNA甲基化的檢測技術

四、腫瘤早篩的市場布局情況

腫瘤早期篩查作為腫瘤預防的重要手段，是未來醫學和檢測技術發展的方向，國內外已有多家公司致力於腫瘤早篩，但大都處於起步階段，技術偏向甲基化產品以LDT形式為主。

據Piper Jaffray測算，2026年液體活檢在早期篩查領域的全球市場容量為150億美元。目前，國內外已經有多家公司將液體活檢技術應用於腫瘤早篩，但多數處於起步階段，正在進行檢測技術的優化、樣本的累積或者前瞻性臨床試驗的驗證。在檢測對象方面，國內外公司更偏向於循環DNA層面的甲基化標誌物。

大多數司開發的腫瘤早篩產品針對結直腸癌、肝癌和肺癌等常見的單一腫瘤類型，也有少數公司研發了泛癌種早篩產品，如萊盟君泰和思勤醫療。此外，市場上的產品大都以LDT的形式提供給終端客戶，僅少數產品獲得了原CFDA（現NMPA）或FDA批准，且基本是基於糞便DNA檢測的腸癌篩查產品。

表1 國內布局液體活檢腫瘤早篩公司

表2 國外布局液體活檢腫瘤早篩公司

五、小結

綜上所述，早期篩查作為腫瘤預防的重要手段，是未來醫學和檢測技術發展的方向，國內外已有多家公司布局腫瘤早篩市場，但大都處於起步階段，技術偏向甲基化產品以LDT形式為主。液體活檢具有無創、可重複性強、樣本獲取方便等優點，有望實現腫瘤早期檢測，提高無症狀高危人群的腫瘤早期檢出率,幫助臨床醫生把握腫瘤的最佳治療時機,有效地提高患者的生存率。未來市場容量巨大。

但液體活檢也不是萬能，基於液體活檢的方式可能很難以100%的特異性和敏感度實現腫瘤早期檢測，也可能無法實現對所有腫瘤的全覆蓋早期檢測。以精準醫學的要求與目標來看，液體活檢的分析效度和臨床有效性有待確認，未來技術上仍需進行多方面的探索和突破，同時，業內亟需建立、完善行業標準和市場監管。

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作者 | 木子鵬

責編 | 老薑