【聚焦外泌體】之從細胞培養上清液中分離外泌體的準備

對於外泌體研究的新手來說，細胞培養上清液是非常好的實驗材料，外泌體相對容易收集。我們可以首先從細胞上清開始來熟悉整個外泌體的研究流程，充分了解整個流程需要使用的儀器、試劑以及準備時間，對我們後續的實驗安排有很大幫助。

其中比較重要的一點是要確定有足夠的初始細胞上清液來收集外泌體，以保證我們能夠拿到足夠多的蛋白、核酸來進行後續分析。我們可以逆向思維，通過後續檢測所需蛋白/核酸量——外泌體量——細胞上清量，來確定初始細胞上清體積。先從細胞上清開始，熟悉了整個過程後，我們再進行其他相對較難的實驗材料進行研究。

無論貼壁細胞或是懸浮細胞，能分泌更多外泌體的細胞系肯定是優先選擇的。一般說來，腫瘤細胞的外泌體分泌水平要高一些，但並不是所有腫瘤細胞系都能分泌足夠多的外泌體，我們可以借鑑文獻中的細胞系推薦¹。以常用基因轉染的HEK293為例，是比較公認的分泌外泌體水平較高的細胞系。或者，以每100ml的細胞上清收集到的外泌體蛋白可達到5~20μg範圍作為標準²，例如我們可以從100ml的細胞上清中獲得10μg的外泌體蛋白，如果後續要做蛋白質組學分析（需50μg蛋白），那麼初始細胞上清就需要擴大到之前的5倍，500ml，500ml上清差不多是通過離心方法可處理的大樣品量了。如果後面收集到的外泌體蛋白都不夠進行一次WB，那就要考慮一下是不是要換個細胞系了。如果外泌體蛋白小於3μg，那麼考慮到擴大體系的實驗難度和後續實驗的順利進行，那證明我們用的細胞系不太合適做外泌體研究。

*雖然很多生物樣品或是細胞系在文獻中沒有出現過，許多外泌體相關的資料庫（ExoCarta, Vesiclepedia, Evpedia等）可以提供幫助，在上面我們可以查到有哪些細胞系已經有人成功進行外泌體提取了。或者也可以諮詢一些做外泌體的生物公司，看看他們是用哪些細胞系來製備商業化的標準外泌體樣品的。

影響外泌體質量和回收率的另外一個重要因素是在收集之前細胞的培養狀態。好的收集時間段是細胞狀態好、生長旺盛，即處於對數期的細胞³，並且在細胞傳代之前收集細胞上清，這個時候細胞所分泌的外泌體量達到高⁴。準備好的細胞上清液，細胞密度也要適合，貼壁細胞如果細胞密度過高會出現接觸抑制，對所分泌的外泌體也會有影響。所以，理想的條件是在細胞融合達到70%~80%後的40~48h後收集外泌體（此時約融合至90%）。

要注意，為了避免FBS外泌體的汙染⁵，收集外泌體的40~48h之前需換成無血清培養基，注意此時40~48h僅作為推薦參考。像有些細胞在無血清培養基培養24h後沒有發生存活率和細胞形態改變，那麼可以進行上清收集。

如果出現死細胞增加、細胞形狀改變、狀態變差等情況時，使用EV-delepted FBS培養基來代替無血清培養基，EV-delepted FBS可以直接購買也可以自己製備（使用SW 41Ti轉頭在4℃，35,000rpm(Rmax 210,000 ×g)離心16h後小心收集上清）。但是這樣仍無法完全避免血清外泌體的汙染，需要清楚樣品中血清外泌體的含量，增加一組沒有培養細胞的培養基的平行樣品作為陰性對照是必要的。

目前被大家認可的方法就是超速離心，因為超離的方法可以收集到完整的細胞外囊泡群，並且幾乎所有的實驗材料（細胞上清、血液、體液等）都可以通過超離的方法來進行外泌體提取。當然超離的方法也有需要改善的地方，比如樣品量很小的情況下，超離對外泌體的回收率不高，但是超離作為一種物理分離的方法，可以在不破壞外泌體群體特性的情況下進行分離的。當前，除了超離外還有許多外泌體分離方法，每種方法都有它的優勢和劣勢，首先我們需要理解各種分離方法的原理和特點，再根據我們的實驗需求才能找到合適的外泌體提取方法。超離方法是可以獲得整個外泌體群體，適合於研究整個外泌體群體特性。

Yoshioka博士：眾多外泌體分離方法中，我們使用超離沉降的方法作為實驗室提取外泌體的標準方法⁵（見下圖）。

這個Protocol主要包括三個步驟：

1.小心收集細胞上清並低速（4℃，2,000xg，10分鐘）去除懸浮細胞（死細胞）。

2.用0.22μm孔徑過濾器過濾上步中收集到的包含外泌體的上清液，去除大顆粒和細胞碎片。

3.將上步中的濾液進行超離處理，使用貝克曼庫爾特SW 41Ti水平轉頭、13.2ml超淨離心管（Product Number:344059，Beckman Coulter），4℃下35,000rpm(Rmax 210,000xg)離心70分鐘。

離心過後外泌體在離心管底聚集成沉澱，通常是肉眼不可見的。然後用預先過了0.22μm孔徑過濾器的PBS進行清洗，洗掉與外泌體一起沉降的成分，例如微顆粒和蛋白。小心傾倒掉第3步超離後的上清，殘留少量液體進行2~3s的渦旋振蕩重懸沉澱，然後加入PBS，重懸後的樣品同樣的條件再進行一次超離。再次超離過後的外泌體仍然需要重懸，傾倒掉上清後，再進行2~3s的渦旋振蕩重懸，這時的外泌體樣品就可以進行下步分析了。從離心管中轉移外泌體樣品到儲存管（比如1.5ml微量離心管）時，在吸取時我們可以用移液槍先大概測量一下樣品體積，後面在儲存管中補充PBS到我們之前預估的樣品體積，比如，我們想收集到100μl的外泌體樣品，但是從離心管中轉移到微量管中只有80μl（注意：使用13.2ml超淨離心管，平均下來每次收集到的外泌體樣品大概80μl），我們加20μl PBS到微量管中再混勻一下就可以保存了。外泌體樣品可以在4℃保存，並且要儘量早的用於分析。另外，外泌體樣品是不能反覆凍融的，與細胞類似，反覆凍融過程會破壞外泌體。

現在大家普遍認為外泌體是具有異質性的，整個外泌體群還可以細分為亞群（例如尺寸、蛋白表達等），不同的亞群也具備不同的特性，正如前文所說，通過超離的方法可以收集完整的外泌體群體。也有些文獻也報導過使用不同的離心條件，可以將尺寸大小不同的外泌體亞群分開。

目前，還沒有特別統一的外泌體超離提取步驟，像轉頭類型、離心管類型、離心力以及離心時間等離心條件在不同的文獻上都會有些許的差異。

1. Yokoi A. In Takahiro Ochiya, Yusuke Yoshioka. Exosomes encourage the medical innovation. Kagaku-Dojin Publishing Co., 2018; p.122-134 [Article in Japanese]

2. Valadi H et al. Nat Cell Biol. 2007; 9(6): 654–659

3. Beckman Coulter. Interview article: Basics and Vision of Exosome Research. 2015

4. Urabe F et al. Clin Transl Med. 2017; 6(1): 45

5. Yokoi A. In Takahiro Ochiya, Yusuke Yoshioka. Exosomes encourage the medical innovation. Kagaku-Dojin Publishing Co., 2018; p.122-134 [Article in Japanese]