外泌體提取的7種方法及其優缺點

2020-11-22 生物谷

 

1、差速離心

差速離心仍然是最常見的外泌體分離技術之一。 該方法包括幾個步驟，包括1）低速離心去除細胞和凋亡碎片，2）更高速離心以消除更大的囊泡，最後，3）高速離心沉澱外泌體：

不過需要注意的是，樣本的粘度與分離的外泌體純度有顯著的相關性，因此，具有高粘度的生物樣品（例如血漿和血清樣本）需要更長的超速離心步驟和更高的離心速度。

步驟： 以300×g離心10分鐘，取上清。 以2000×g離心10分鐘，取上清。 10，000×g離心30分鐘，取上清。 100，000×g，在4℃下持續離心90分鐘，去掉上清，留下的沉澱PBS重懸後，再次以100，000×g離心90分鐘。

2、密度梯度離心

該方法將超速離心與蔗糖密度梯度相結合，實現外泌體與非囊泡顆粒分離，例如蛋白質和蛋白質/RNA聚集體。 因此，該方法將囊泡與不同密度的顆粒分開，能夠提取含量低的外泌體。 但是，合適的離心時間非常重要，否則如果它們具有相似的密度，則仍可在外泌體中發現汙染顆粒。 2018年Li K等人改良了此方案，回收率更高、純度更高，並且結構和功能保持更好（Li K， Wong D， Hong K， Raffai R. Cushioned-Density Gradient Ultracentrifugation (C-DGUC)： A Refined and High Performance Method for the Isolation， Characterization， and Use of Exosomes. Methods Mol Biol. 2018；1740：69-83[1]）

3、尺寸排阻色譜

尺寸排阻色譜（Size-exclusion chromatography，SEC）是基於大小而非分子量實現分離大分子。 該技術應用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根據其直徑通過微球，半徑小的分子需要更長的時間才能通過色譜柱的孔隙遷移，而大分子則從色譜柱中更早地洗脫。 尺寸排阻色譜可以精確分離大小分子。 此外，可以將不同的洗脫溶液應用於該方法。 與離心方法相比，色譜分離已被證明具有更多優勢，因為通過色譜分離的外泌體不受剪切力的影響，這可能會改變囊泡的結構。 目前，SEC是一種廣泛接受的分離血液和尿液中外泌體的技術。 不過，該方法耗時較長，不適合大量樣本處理。

4、過濾

超濾膜也可用於分離外泌體。根據外泌體的大小，從蛋白質和其他大分子中分離外泌體。 最常見的過濾膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔徑，可用於收集大於800nm、400nm或200nm的外泌體，也有設計成微柱多孔矽纖毛結構以分離40-100nm外泌體：

不過，該方法由於過濾膜的粘附，可能會損失外泌體，並且過濾時的壓力和剪切力，可能會使外泌體變形受損。

5、基於聚合物的沉澱技術

基於聚合物的沉澱技術通常包括將樣本與含聚合物的沉澱溶液混合，在4℃溫育並低速離心。用於聚合物沉澱的最常見聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。用這種聚合物沉澱具有許多優點，包括對分離的外泌體影響小、pH中性等。目前大多數快速分離外泌體的商品化試劑盒都是基於此方法。 然而基於聚合物的沉澱方法可能會同時分離非囊泡汙染物（包括脂蛋白）而且，聚合物材料的混雜可能會影響下遊分析。

6、免疫分離技術

免疫分離外泌體的原理大多是通過抗體包被的微球，特異性結合外泌體。 例如使用抗腫瘤相關HER2和EpCAM的抗體從腫瘤細胞中分離出腫瘤來源的外泌體。 然而，使用抗體包被珠子的分離不適合從大量樣本中獲得外泌體。

還有將抗體包被於ELISA中的那種板上面，直接分離後檢測、分析、定量。最近的一項研究已應用免疫親和超順磁性納米粒子（ISPN）來結合外泌體，研究人員通過連接抗CD63抗體和納米粒子生成ISPN，並用它們從體液中分離外泌體。

7、通過篩分分離

該技術利用壓力或電場，通過膜從樣本中篩出外泌體：

該方法分離時間短，可以提供較高純度的外泌體。 但是回收率低。(生物谷Bioon.com）

 

 


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