一管血檢測癌症，是全球醫學界共同的夢想。液體活檢作為傳統活檢的替代技術，通過非侵入性的取樣方式獲得腫瘤信息，輔助癌症治療，是精準醫療代表性的診斷技術。液體活檢的主要檢測物包括血液中的循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和外泌體(exosomes)。作為液體活檢領域的"三駕馬車"之一，外泌體是細胞間信號轉導的重要載體，具有豐富的可檢測靶標(蛋白、DNA、RNA、脂質等)。雖然有大量的證據表明外泌體及其內容物具有成為新型診斷標誌物的潛能，但其進入臨床仍面臨很多障礙。
一、外泌體檢測的興起
1986年，Johnstone等[1]在體外培養的綿羊紅細胞培養液上清中發現外泌體，1996年Raposo等[2]發現B淋巴細胞分泌的外泌體攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激因子和黏附因子。2007年Lotvall和Valadi[3]發現，細胞之間可以通過外泌體中的RNA來交換遺傳物質。
2013年諾貝爾生理或醫學獎授予從事細胞內囊泡(外泌體)運輸調控機制研究的3位科學家，James E. Rothman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof，由此將外泌體研究推向了前所未有的新高潮[4]。2015年6月24日美國德克薩斯大學安德森癌症中心研究團隊通過大量胰腺癌患者血清標本分析發現，早期胰腺癌患者血清中GPC1(glypican-1)陽性的外泌體豐度顯著高於正常人群及慢性胰腺炎患者，可以作為一種非侵入性診斷和篩查處於適合手術治療階段的早期胰腺癌的標誌物。
2016年1月，Exosome Diagnostics公司推出世界首款癌症外泌體診斷產品ExoDx Lung(ALK)，實時檢測非小細胞肺癌患者EML4-ALK突變，公司官方公布的檢測診斷敏感度為88%，特異度為100%。此後該公司相繼推出肺癌外泌體檢測產品ExoDx LungT(790M)、ExoDx Lung(EGFR)，前列腺癌的尿液外泌體活檢產品ExoDx？Prostate。癌症診斷領域之外，越來越多的公司參與到了研發基於外泌體為基礎的診斷產品研發中，以Exosome Science公司為代表，陸續發布外泌體生物標誌物診斷、監測阿爾茨海默病、慢性創傷性腦病和其他神經系統疾病的研究數據。
外泌體在短短30多年的研究歷程中，從基礎研究走到了臨床應用，成為液體"火"檢三大標杆之一，與此同時外泌體也成為了資本市場追逐的焦點。Codiak BioSciences公司自2015年成立以來，募集總額達1.685億美元。韓國外泌體幹細胞治療公司ExoCoBio，成立後4個月內A輪融資1 100萬美元，成為韓國規模最大、投資最快的投資項目。國外已有多家公司推出外泌體分離試劑盒，國內也有多家從事外泌體檢測服務的企業，分散分布於以液體活檢公司為基本框架奠定的市場產業鏈中，包括：研究上遊外泌體的提取、鑑定，試劑儀器供應市場；中遊外泌體核酸擴增、蛋白質譜檢測服務市場；下遊數據分析市場。
雖然作為新型液體活檢標誌物，"新寵"外泌體被炒得火熱，但仍需理性期待這一技術的應用。至少目前為止，幾乎所有外泌體診斷產品都處於實驗室開發的測試階段，鮮有走出科研進入臨床應用的。
二、面臨的挑戰
(一)外泌體分離鑑定
建立快速、低成本、高純度的外泌體捕獲、鑑定、定量方法體系是外泌體進入臨床檢驗的前提。目前最常用的外泌體分離富集方法為超高速離心法、聚合沉澱法、免疫親和法、超濾法和凝膠排阻層析法[9]。
目前有多種商品化外泌體分離試劑盒，包括基於聚合沉澱法的ExoQuick？(美國System Biosciences公司)、Total Exosome Isolation Reagent (美國Invitrogen公司)；基於免疫磁珠親和法的Exosome-Human CD9/CD81/CD63/CD81/EpCAM(美國Invitrogen公司)、Isolation Reagent Mag Capture？ Exosome Isolation Kit PS(日本Wako公司)；基於超濾法exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (德國QIAGEN公司)等。
商品化試劑盒多採用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)為多聚物的沉澱法、超濾法和免疫學方法分離外泌體。沉澱法以SBI公司生產的ExoQuick？(美國System Biosciences公司)試劑盒為代表，操作簡便，不需要額外的設備。然而PEG沉澱會夾雜分離大量雜質(蛋白、脂類等)，此外，存在於分離物中的聚合物也可能會干擾下遊分析[9]。免疫法利用包被單克隆抗體的磁珠結合外泌體，可保證外泌體形態的完整，特異性高。使用抗腫瘤相關的HER2和EpCAM抗體可以分離出腫瘤特異性外泌體[10，11]。然而，免疫沉澱需要特異性抗體，檢測成本高，且僅能捕獲表達特定抗原的目標外泌體，漏檢率高。離心法是科研提取外泌體最常用的方法，但所需樣本量大、耗時、回收率低(5%～25%)；凝膠排阻層析可以分開雜質獲得高純度外泌體，但受處理樣本體積限制。微流控晶片集外泌體分離與檢測為一體，但需要填充管道，損失外泌體檢測體積[9]。目前各類外泌體分離方法僅用於科學研究，遠不能達到臨床檢測要求。
分離後的外泌體可通過多種電子顯微鏡進行形態學檢測，如掃描電鏡、透射電鏡、冷凍電鏡及原子力顯微鏡，目前研究文獻中使用最多的為透射電鏡；採用免疫印跡、流式細胞術等技術鑑定特異性表面蛋白標誌物。外泌體是由細胞內多囊泡體與細胞脂膜融合後向細胞外分泌的囊泡，因此存在脂質雙分子層結構，包括跨膜蛋白、細胞內源性蛋白、膜表面蛋白等(圖1)。不同細胞來源外泌體蛋白成分存在差異。國際細胞外囊泡學會發布"證明樣品中存在外泌體的最低實驗要求"指導性文件中提出，採用蛋白標誌物鑑定外泌體時，應同時檢測到所分離樣品中至少存在1個跨膜蛋白(如四次跨膜蛋白CD9、CD63，黏附分子等)、1個細胞內源性蛋白，如腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSGl01)、膜聯蛋白A(annexin A，ANXA)、Rab家族蛋白(Ras-related protein Rab，Rab)，而不存在內質網來源蛋白，如鈣聯接蛋白(calnexin， CANX)、高爾基體基質蛋白(Golgi matrix protein，GM130) 或核蛋白[12]。
圖1
外泌體結構示意圖
當下外泌體研究中最棘手的問題之一是如何準確測量評估外泌體純度。滿足檢測需求的外泌體純度，是後續內容物檢測的前提。目前有兩種從不同維度衡量外泌體濃度的指標：(1)外泌體蛋白濃度；(2)外泌體顆粒數。外泌體蛋白濃度通常使用二喹啉甲酸微量蛋白濃度試劑盒測定，外泌體顆粒數測量方法包括光學方法如納米顆粒跟蹤分析，動態光散射和流式細胞術[13]，以及非光學方法，如電阻式脈衝傳感，透射電子顯微鏡和拉曼光譜[14]。目前尚不能通過單一方法準確定量外泌體純度和濃度，未來的檢測趨勢是計算囊泡比率濃度(即"蛋白質與顆粒"比率)[13]。
(二)外泌體成分檢測
外泌體中含有多種核酸以及蛋白類等物質，可從不同角度監測腫瘤的進展與轉歸預後等的關係[14，15]。每毫升血液中僅有1～10個CTC，而每毫升血液含有1×109個外泌體，含量極高。外泌體的脂膜結構對所包含的核酸分子起到良好的保護作用，具有更高的穩定性[16]。外泌體的粒徑較小，通透性強，容易到達各種體液中，是液體活檢的前提條件；此外所有細胞都能分泌外泌體，包括腫瘤細胞及相關的免疫細胞，故能反映腫瘤微環境等多種信息。外泌體分離鑑定後，根據檢測需求選取不同下遊技術檢測外泌體表面標記物或內容物，包括流式細胞術、質譜或二代測序等。那麼何種成分檢測最有可能在臨床檢驗開展？
外泌體胞漿來源的屬性決定其DNA含量很少，缺乏DNA檢測信息。檢測技術層面來說，蛋白不能擴增，很多重要的低豐度蛋白無法通過現有檢測手段檢出，蛋白檢測需要寄希望於高敏感檢測方法研發。外泌體內RNA可以進行擴增，目前外泌體RNA研究主要有兩個方向，一種是利用測序技術直接獲取RNA序列信息，另一種則是利用RNA擴增技術檢測包含特定序列RNA濃度[17]。前一種需要將特定序列捕獲，分離純化再進行測序，高通量測序技術可發現新的突變，但費用較高且檢測時間略長；擴增子測序則使用特定的引物對樣品進行多級PCR後純化獲得特定序列進行測序，臨床應用簡便易行，可動態監測突變位點，但需要提前了解腫瘤基因的突變信息。受益於測序技術的發展，RNA可能是有望最早成熟的外泌體成分檢測技術。
然而，不管是外泌體核酸檢測還是蛋白檢測，最終都需要對數據進行深度分析處理以及解讀。現階段國內生物信息挖掘平臺和人才，大多儲備於商業性的基因組學服務企業。從短期來看外泌體測序檢測只能服務於少部分經濟條件允許的患者，而作為臨床常規檢測項目開展需要多學科的協同發展。
(三)檢測質控標準
將外泌體研究成果轉化為臨床應用面臨的關鍵障礙是缺乏標準化的技術規範，包括檢測前(標本選擇問題)，檢測中(檢測方法及鑑定統一標準問題，不同的內容物分析，不同檢測手段)及檢測後的每一個環節。
分析前質量控制，雖然處在檢測標本進入實驗室之前的環節，但卻恰恰是最重要的環節。有明確證據表明血漿是外泌體分析最佳血液標本類型，樣本收集應使用細胞穩定管或EDTA抗凝血管[18]。但其他可能影響外泌體檢測的分析前多種變量，如樣本收集、樣本處理、儲存條件和時間以及與患者有關的生物因素等，仍不明確，需要進一步研究。
任何臨床檢測需要以檢測方法的有效性為前提，尤其要注意接近檢測下限的結果。較為理想的情況是能夠有標準化的樣品作為比較，然而目前外泌體標準品領域幾乎為空白，幾乎所有外泌體診斷研究均採用自建檢測方法、自建檢測區間。
高靈敏度和高特異性的檢測一直是臨床檢驗所期待的。外泌體因其獨特的形成機制，豐富穩定的內容物，被譽為目前最理想的液體活檢分析材料。然而高靈敏度的檢測需要嚴格控制才能避免假陽性。由於缺乏統一的檢測方法和標準，目前已公布外泌體研究結果的有效性、可重複性以及結果的通用性依然存疑。現階段不同研究實驗室使用的方法各異，檢測的具體細節不同，不同外泌體檢測可能無法給出相同的結果，研究結果具有不可比性。除已獲批准的檢測外，大多數外泌體檢測方法的臨床有效性和實用性缺乏相應的證據，尚需進一步研究。目前還沒有確切的臨床證據表明外泌體檢測在臨床試驗之外能夠用於腫瘤療效監測、早期診斷或篩查。檢測結果可比性、穩定性、有效性未明是外泌體檢測進入常規臨床的主要障礙。
三、外泌體檢測的應用前景
外泌體檢測是一項富有挑戰性的新技術，在精準醫學中扮演著越來越重要的角色。隨著精準醫療納入國家"十三五"規劃，國家科技部決定在2030年前投入600億用於發展精準醫療，國家衛生計生委也發布了一系列腫瘤診斷和高通量測序相關的文件和指南。外泌體相關研究定會乘著國家精準醫療戰略的東風，實現長遠發展。外泌體聯合新一代測序技術、質譜分析技術將有望實現：疾病的早期篩查、實時監控、治療反應監控、預後判斷。此外，外泌體的診斷價值將更多展現在與CTC、ctDNA、傳統腫瘤標誌物的綜合應用，充分結合ctDNA高靈敏度，CTC高特異性，實現疾病診斷全息化。未來，液態活檢各種方式的聯合使用將是大趨勢。
目前外泌體檢測還處在早期發展階段，尚未開展多中心、大樣本的基礎以及臨床研究，缺乏有價值的科研資料指導臨床。外泌體檢測真正進入臨床，需要提高檢測技術的靈敏度和特異性；實現血液採集系統和分析步驟等的標準化；通過多中心臨床試驗驗證檢測的臨床效果。外泌體研究發展之路需要突破技術瓶頸、需要政策扶持，更需要符合倫理、合理引導、限定範圍的有效監管。但隨著廣大科研工作人員的堅持不懈的探索和研究，新技術的出現和發展，分離檢測流程的不斷優化，外泌體必將會成為精準醫療疾病診斷領域的一塊重要陣地。(生物谷Bioon.com）
小編推薦會議 2020（第五屆）外泌體與疾病研討會
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