CUT&Tag技術用於棉花染色質H3Kme3修飾研究

2020-10-16 鹿明蛋白組代謝組

自2019年CUT&Tag技術被報導以來，見刊的文章都是將該技術用於動物細胞或者組織的研究，鮮少有用於植物樣本的數據，本文介紹的是發表於2020年8月份的一篇將CUT&Tag技術用於植物細胞核樣本的案例。該案例將ChIP-seq和CUT&Tag做了對比，通過數據比較展示了CUT&Tag技術用於植物樣本的優勢。


材料及方法

1. 植物材料：異源四倍體棉花四周齡幼苗的根、葉片和20天棉鈴的纖維樣本。


2. Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5轉座酶（諾唯贊）

註：抗體與pG-Tn5/pA-Tn5的親和性需要確認。通常，pA和pG具有廣泛的抗體親和特性，然而，pA與兔源抗體具有更高的親和性而pG與鼠源抗體具有更高的親和性。


3. 抗體：

1） H3Kme3（Millipore cat. no. 07-473, 1mg/ml），該抗體為兔多克隆抗體，用於研究組蛋白第三亞基四號賴氨酸的三甲基化修飾。

2） 兔IgG（Millipore cat. no. 12-370，1mg/ml）,作為 CUT&Tag實驗的對照抗體。


研究結果

1. CUT&Tag和ChIP-seq的流程對比圖

圖1


從圖1 可知，CUT&Tag在操作上比ChIP-seq要簡便許多：

1）CUT&Tag採用原位策略，不需要使用交聯來穩定蛋白-蛋白和蛋白-DNA之間的相互作用。交聯樣本由於使用甲醛而導致後續用20%的Triton進行細胞核分離存在困難。

2）在CUT&Tag實驗中，使用完整的細胞核和抗體共孵育，細胞核使用洋地黃皂苷在核膜上打孔利於抗體的進入，但是不破壞核的完整性。

3）ChIP-seq實驗中，染色質從分離的細胞核中提取出來之後要進行超聲破碎，將DNA打斷成300-500bp的小片段，此過程耗時較長，在免疫共沉澱之後，如果不解交聯，DNA很難抽提出來；

4）最後，ChIP得到的DNA進行建庫比CUT&Tag多耗時4-5個小時。


2. CUT&Tag使用的細胞核可以通過DNA測定進行半定量

植物細胞存在細胞壁，抗體很難進入細胞，作為替代方案，可以使用細胞核作為起始材料進行實驗。對於CUT&Tag實驗所需的細胞核進行顯微鏡觀測定量是比較困難的，因為分離的細胞核容易聚集成團，本文通過抽提的DNA來對所投入的細胞核進行了定量，結果表明，大約1.5μg的DNA就可以滿足CUT&Tag實驗的要求。1g根和4g纖維大致相當於15-20μg的染色質，可以滿足約10次CUT&Tag實驗。

圖2


3. CUT&Tag生物學重複顯示高重複性及高信噪比

實驗設計了2個生物學重複，IgG抗體作為CUT&Tag實驗對照；同樣的實驗材料也進行了ChIP-seq實驗，ChIP mock反應不加H3Kme3抗體作為對照。

結果顯示：CUT&Tag-IgG對照顯示了低背景信號，兩個生物學重複的CUT&Tag實驗建庫成功，峰型符合預期（圖3）。

圖3


對所有文庫進行測序後，數據比對結果見表1，CUT&Tag文庫最後得到的數據10.61、15.3和14.16M，而ChIP-seq得到的數據是23.17和31.34M。


表1


對數據進行相關性分析表明：CUT&Tag的兩個生物學重複和CUT&Tag_IgG的相關性很低，只有0.01（圖4a），表明CUT&Tag實驗組和對照組差異明顯；對ChIP-seq的對照和實驗組進行相關性分析結果顯示，二者的相關性為0.89（圖4a），說明兩組數據的信噪比較差。對CUT&Tag實驗組的兩個生物學重複進行相關性分析結果表明二者的相關性為97%，說明生物學重複較好（圖4b）。

圖4


對各個樣本分別隨機抽取6-24M數據進行分析，結果如表2所示：在抽取同樣數據量的情況下，CUT&Tag鑑定到的peak數量更多，CUT&Tag在6M數據量時鑑定到的peak數量為42367個和46779個，而ChIP-seq在數據量達到24M時鑑定到的peak數量為40859個。這說明CUT&Tag的靈敏度更高。表2括號中的數字為FRiP（fraction of reads in peaks），CUT&Tag的FRiP為0.66-0.7，說明CUT&Tag實驗結果具有很高的信噪比；而ChIP-seq的FRiP僅為0.11，說明其信噪比較低。


表2


對兩種方法所得peak進行分析發現25,597 (54.7–62.6%) peaks 為 CUT&Tag 和 ChIP-seq共有, 37,168 (79.5–87.7%) peaks 是CUT&Tag兩個生物學重複共有的，這說明了CUT&Tag的生物學重複非常穩定（圖5）。

圖5


將所得的peaks分為8類：1–2 kb 啟動子 (1–2 kb 5′ upstream of translation starting site)；1-kb 啟動子(≤ 1-kb 5′ upstream of translation starting site)；第一外顯子,第一內含子, 其它外顯子, 其它內含子, 1-kb 下遊 (≤ 1-kb 3′ upstream of translation terminating site)和基因間區（除以上所描述區域），結果發現，兩種實驗方法所得結果高度一致（圖6）。

圖6


研究結論

綜上所述，利用植物細胞核進行CUT&Tag實驗研究表觀基因組學具有實驗流程簡單，有效數據留存率高，信噪比高，結果準確的優勢。



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