何川等合作開發基於新型化學交聯"平臺"的染色質構象捕獲技術

責編丨兮

染色質構象捕獲技術（3C和Hi-C）及其衍生技術（DNase Hi-C和Micro-C ）發現並解析出染色體在不同層級上、不同解析度下的摺疊形式。現有的染色質構象捕獲技術依靠甲醛交聯蛋白與DNA，通過限制性內切酶或者DNase, Mnase對DNA進行酶切，再將空間上鄰近的DNA重新連接。將重連後的DNA文庫通過高通量測序，分析比對其來源並繪製染色質互作圖譜。通過這種互作圖人們發現多種染色體摺疊形成的結構，其中包括染色質環【1】、染色質結構性條紋（stripe）、染色質結構域、拓撲結構域【2】以及活躍與失活的區室【3】。

然而利用甲醛交聯DNA和蛋白的反應是可逆的，且交聯產物並不穩定。此外，交聯於DNA上的蛋白在空間上有概率阻擋限制性內切酶識別DNA，造成DNA不完全酶切。因此在不同細胞中連接位點也會不同，大大增加了異質性從而增加染色質互作圖上的「背景」，影響染色質結構的正確解析。此外，相比於限制性內切酶，DNase和MNase能將DNA切成更小的片段，因此基於DNase和MNase發明的衍生技術DNase Hi-C和Micro-C能大大提高染色質互作圖的解析度【4】。然而由於依舊是依靠甲醛交聯DNA和蛋白，DNase和MNase將更偏向於酶切染色質開放區域。因此觀測到的染色體結構也會有偏好性。

2020年8月24日，芝加哥大學何川實驗室聯合康乃狄克大學歐陽正清實驗室及加州大學聖地牙哥分校任兵實驗室在Nature Biotechnology上發表文章Direct DNA crosslinking with CAP-C uncovers transcription-dependent chromatin organization at high resolution。研究人員開發了一種基於樹枝狀高分子（PAMAM dendrimer）修飾的新型化學交聯「平臺」，將空間上鄰近的DNA直接共價交聯在一起從而捕獲染色質構象，並將這種技術命名為CAP-C (chemical-crosslinking assisted proximity capture)。和蛋白-DNA交聯不同的是，這種樹枝狀高分子不會影響酶切，從而有效降低了染色質互作圖上的背景。聯合DNase酶切，提高染色質互作圖的解析度的同時也不帶來任何偏好性。

相比於Hi-C，CAP-C能夠捕獲到完全相似的染色質結構（loop，stripe，TADs，compartment）。由於CAP-C染色質互作圖「背景」更低，有更多的小於50Kb大小的染色質結構域被發現，同時也使得CAP-C能夠檢測到更多的染色質環。相比於此前人們發現的染色質結構域（例如TADs），這些小染色質結構域的邊界（boundary）富集了更多的H3K4me3，H3K27ac組蛋白修飾。並且有部分基因獨立形成了一個染色質結構域（圖1）。

圖1. CAP-C實驗設計。CAP-C能有效提高染色質互作圖上的「信噪比」，幫助發現更多染色質精細結構。

研究人員進一步將結構域分為環狀（loop）結構域和非環狀（non-loop）結構域，同過對比環狀結構域，發現非環狀結構域顯著性的更小；有更多的H3K4me3，H3K27ac組蛋白修飾富集於非環狀結構域的邊界；非環狀結構域裡的基因轉錄水平更高。近年來有大量研究表明環狀結構域可能是通過cohesin和CTCF形成的染色質環在DNA上滑動擠壓形成的【5】。而鮮有研究證明非環狀結構域的形成機制。研究人員發現敲除CTCF更顯著的降低了環狀結構域中的染色質互作而抑制轉錄則更顯著的降低了非環狀結構域中的染色質互作。因此研究人員推測形成這兩種結構域的分子機制可能不同 （圖2）。

圖2. 環狀結構域和非環狀結構域的對比。

研究人員還進一步發現若基因內部存在活躍的可選擇性啟動子，會在該啟動子的位置上形成結構域邊界並將一個基因分割進多個結構域中。若抑制轉錄水平，這些邊界將變得不再那麼明顯。通過比較這些啟動子上的RNA聚合酶II和CTCF的水平發現，RNA聚合酶II及CTCF的結合併不是這些結構域邊界的形成所必須的，該結果與之前的研究發現類似【6】。因此研究人員推測這些結構域邊界可能有其他更多的活躍轉錄機器共同調控形成。此外，激活異染色質上的轉錄將在轉錄位置形成結構域邊界，並出現B 區室向A區室的轉換。同樣的，結構域邊界的形成及區室的轉換與轉錄激活相關但與 RNA聚合酶II的結合無關。

研究人員還觀察到當抑制轉錄後會增強部分區域染色質互作，這是之前從未報導過的現象。研究人員發現這些區域通常是由兩個或多個高表達基因的啟動子互作形成的。抑制轉錄後，這些啟動子上的RNA聚合酶II水平顯著的上升，由RNA聚合酶II介導的染色質環也顯著的增加。通過抑制RNA聚合酶II與啟動子的結合，這些區域將不再出現染色質互作。由於該結構的形成與轉錄起始及RNA聚合酶II與啟動子的結合相關，因此研究人員將這些區域命名為轉錄起始簇（transcription initiation cluster，TIC）。此前有大量研究表明RNA聚合酶II在體內能夠通過相分離形成聚合體【7】，因此研究人員猜測這種染色質結構的形成可能與相分離有關。具體的分子機制還有待更多的實驗證據（圖3）。

圖3. 轉錄起始簇

由於樹枝狀高分子（dendrimer）是一個分子大小可調控的高分子，其大小是通過高分子合成代數（generation）控制的，代數越大分子越大，因此所修飾形成的交聯平臺也越大，理論上能夠抓住空間上相距更遠的DNA。研究人員通過比較不同大小的交聯平臺所捕獲的染色質構象發現，小的樹枝狀高分子（如G3）捕獲到更多B 區室間的染色質互作而大的樹枝狀高分子（如G5或者G7）捕獲到更多A區室間的染色質互作。由於B區室與異染色質相關，小的樹枝狀高分子更容易鑽進纏繞緊密的異染色質之間；而A區室與常染色質相關，大的樹枝狀高分子通過碰撞能捕獲到更多鬆散的常染色質結構。因此觀測到的實驗結果符合預期。研究人員進一步通過對大小不同的樹枝狀高分子所捕獲的染色質互作區域進行主成分分析發現區室並不是只存在於低分變率下的染色質結構。同樣在高解析度下也存在。研究人員在老鼠，人和果蠅細胞中均發現了之前並未報導過的精細的區室結構的存在。這些不同大小的樹枝狀高分子交聯平臺在未來可能可以作為「分子尺「，測量並繪製染色體的三維結構（圖4）。

圖4. 精細的區室結構存在於各類物種中。

圖4中，染色質被小樹枝狀高分子（G3）更多的捕獲的區域用紅色標註，染色質被大樹枝狀高分子（G5或G7）更多的捕獲的區域用藍色標註。

總的來說，CAP-C發現了之前並未報導過的染色質精細結構（small non-loop domain，compartment及TIC），這些結構均與轉錄相關。具體的分子機制還有待更多的實驗結果去證明闡釋。究竟轉錄是否會影響染色質結構還是一個未解的難題，需要結合更多的生物學研究方法來論證。CAP-C作為新型的交聯方法，可預見其應用前景十分廣泛。由於樹枝狀高分子能夠直接交聯DNA，CAP-C理論上也能捕獲天然染色質（native chromatin）的結構。而天然染色質可能更能反映染色體在生理狀態下的摺疊情況。此外，CAP-C的交聯方式可以與其他下遊實驗相結合，例如（GAM或SPRITE）【8,9】，從而可以通過多個角度來研究染色體結構。樹枝狀高分子上也可被修飾其他化學官能基團，使得CAP-C能夠更廣闊的應用於捕獲其他大分子間的相互作用（RNA-RNA, RNA-DNA）。

據悉，何川課題組遊乾承博士和谷茜博士以及歐陽正清課題組Anthony Cheng為本文的共同第一作者，何川教授為本課題設計提供了指導和支持，歐陽正清教授指導了數據挖掘和統計分析，任兵教授為數據解讀提供了指導。

原文連結：

https://doi.org/10.1038/s41587-020-0643-8

製版人：十一

參考文獻

1. Rao, S. S. P. et al. A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping. Cell 159, 1665–1680 (2014).

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3. Lieberman-Aiden, E. et al. Comprehensive Mapping of Long-Range Interactions Reveals Folding Principles of the Human Genome. Science 326, 289–293 (2009).

4. Hsieh, T. H. S. et al. Resolving the 3D Landscape of Transcription-Linked Mammalian Chromatin Folding. Mol. Cell 78, 539-553.e8 (2020).

5. Rao, S. S. P. et al. Cohesin Loss Eliminates All Loop Domains. Cell 171, 305-320.e24 (2017).

6. Bonev, B. et al. Multiscale 3D Genome Rewiring during Mouse Neural Development. Cell 171, 557-572.e24 (2017).

7. Lu, H. et al. Phase-separation mechanism for C-terminal hyperphosphorylation of RNA polymerase II. Nature 558, 318–323 (2018).

8. Beagrie, R. A. et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature 543, 519–524 (2017).

9. Quinodoz, S. A. et al. Higher-Order Inter-chromosomal Hubs Shape 3D Genome Organization in the Nucleus. Cell 174, 744-757.e24 (2018).