『銳幫讀』全基因組測序探究希瓦氏菌中與海綿共生相關的基因

2021-01-16 銳翌生物

希瓦氏菌（Shewanella）在淡水和海水環境中都廣泛存在，有的浮遊生長，有的在其他生物體表寄生，人們對與海綿共生的希瓦氏菌的了解還很有限。本文對從潮間帶海洋海綿Ophlitaspongia papilla分離出的Shewanella sp. OPT22菌進行了基因組測序，並與其他68個希瓦氏菌的基因組進行比較（包括兩株之前報導的與海綿相關的菌Shewanella spongiae KCTC 22492 和Shewanella sp. Alg231_23），探究與海綿共生的希瓦氏菌特徵。

題目：Whole-Genome Comparisons Among the Genus Shewanella Reveal the Enrichment of Genes Encoding Ankyrin-Repeats Containing Proteins in Sponge-Associated Bacteria

譯文: 希瓦氏菌屬全基因組比較揭示海綿相關細菌富集含錨定蛋白重複序列的蛋白編碼基因

期刊名：Frontiers in Microbiology

年份：2019   IF：4.259

通訊作者：Anoop Alex和Agostinho Antunes

通訊單位：波爾圖大學


測序平臺：Illumina HiSeq 2500

測序策略：100bp雙端測序

組裝軟體：Velvet v1.2.10

通過BLASTn對測序所得Shewanella sp. OPT22的16S rRNA基因序列進行相似性搜索，找到與其高相關性的菌（表1）。基於16S的進化分析表明從大西洋海綿Ophlitaspongia papilla分離出的Shewanella sp. OPT22菌與從韓國海域海綿分離出的S. spongiae KCTC 22492菌，以及從其他地理位置分離出的海綿、珊瑚相關菌聚在一起（圖1）。然而從大西洋的葡萄牙海岸線海綿Spongia officinalis分離的Shewanella sp. Alg231_23菌與阿爾沃蘭海200-300米深處分離的S. woodyi ATCC 51908菌聚在一起（圖1）。


基於全基因組的系統發生樹，Shewanella sp. Alg231_23和S. woodyi ATCC 51908依然聚在一起，而Shewanella sp. OPT22 和S. spongiae KCTC 22492聚在一起（圖2）。平均核酸一致性分析（ANI）也證明了Shewanella sp. Alg231_23和S. woodyi ATCC 51908近的進化關係（ANI值達到97%）。本研究中的Shewanella sp. OPT22菌序列顯示它可能是一個接近於S. irciniae的新菌。


表1 與Shewanella sp. OPT22 16S rRNA基因序列一致性較高的菌

圖1 基於16S rRNA基因序列的希瓦氏菌的系統發育樹


對Shewanella sp. OPT22基因組進行組裝，共得到69個contigs，染色體基因組大小在4.4 Mbp，具有低的GC含量（39.6%）（圖3A）。組裝的基因組接近完整（93.6%），可能有輕度的汙染，該基因組包含3971個基因，其中3840個編碼蛋白質，108個編碼RNA。三種菌（Shewanella sp. OPT22，S. spongiae KCTC 22492和Shewanella sp. Alg231_23）的詳細基因組特徵列在表2中。


比較三個海綿相關的希瓦氏菌COG，發現COG『C』（能量生成和轉化），『E』（胺基酸運輸和代謝），『G』（碳水化合物運輸和代謝），『H』 (輔酶運輸和代謝），『K』（轉錄），『M』（細胞壁/膜生物合成），『O』（轉錄修飾，蛋白質轉換，分子伴侶），『P』（無機離子運輸與代謝），『Q』（次級代謝產物合成、運輸、分解），『R』（大致功能預測），『S』（未知功能），and 『T』（信號轉導機制）在Shewanella sp. Alg231_23中顯著提高（圖4）。這種趨勢考慮到Shewanella sp. Alg231_23（5.8 Mbp）比Shewanella sp. OPT22（4.4 Mbp）和S. spongiae KCTC 22492（4.9 Mbp）具有更大的基因組。許多證據表明，功能基因含量與基因組大小相關，負責調控和次生代謝的基因在較大基因組中不成比例地富集。COG功能基因在兩個相近的海綿相關菌Shewanella sp. OPT22 和S. spongiae KCTC 22492中分布較一致。


圖3 與海綿相關的希瓦氏菌染色體圈圖。(A) Shewanella sp. OPT22 (B) S. spongiae KCTC 22492


Shewanella sp. OPT22基因組編碼類真核蛋白（eukaryotic-like proteins，ELPs）序列，比如錨定蛋白重複序列（ANKs），tetratricopeptide repeat（TPRs）以及Sel1重複序列。ELPs（共生因子）通常在病源和共生菌中檢測到，在宿主細胞內存在，通過幹擾宿主蛋白與蛋白的相互作用致病。本研究中海綿相關Shewanella sp. OPT22檢測到大量含錨蛋白重複序列 （ANKs, n=45; p<0.01）的蛋白，而其他菌的ANKs少於10個（六個菌沒有檢測到ANKs）（圖5），Shewanella sp. OPT22中ANKs的過表達可能是該細菌海綿與生活方式相關的一個關鍵特徵。S. spongiae KCTC 22492也具有大量的ANKs（n=52）。Shewanella sp. OPT22和S. spongiae KCTC 22492中的ANKs可能促進宿主免疫逃逸，使菌在海綿宿主中成功定植。有趣的是其他ELPs，比如TPRs和Sel1在本研究納入的菌中都廣泛分布，與分布地點和生活方式無關。


另一個海綿相關菌Shewanella sp. Alg231_23，具有低豐度的ANKs（n=4）和Sel1重複序列（n=6），具有高豐度的TPRs（n=41），從魷魚中分離的S. woodyi ATCC 51908也有這種趨勢（ANKs, n=6; Sel1, n=4; TPRs, n=42）。前面的分析表明Alg231_23在系統進化上更靠近S. woodyi ATCC 51908，而不是OPT22，說明系統進化史對TPRs的豐度有影響，而不是生活方式。不過該結論需要對更多的菌進行分析來確認。


圖5 希瓦氏菌中檢測到的類真核蛋白(eukaryotic-like proteins，ELPs)相對豐度。加粗字體表示與海綿相關的菌。


共生菌利用多種方法定植和入侵真核宿主，其中一種特殊的運輸系統，即分泌系統（SSs），將蛋白跨膜運輸以抑制宿主免疫反應、促進細菌入侵。KEGG分析檢測到Shewanella sp. OPT22中編碼type III SS (T3SS) (M00332)，type IV SS (T4SS) (M00333)，type VI SS (T6SS) (M00334)（圖6、圖7）的基因，表明該菌可能具有將效應/毒力分子注入宿主細胞，建立海綿-菌相互作用的能力。


III型分泌系統是一個複雜的機制，為共生菌和致病菌提供了獨特的毒力機制，使它們能夠將效應蛋白從細菌胞質注入宿主細胞的細胞質/質膜。在Shewanella sp. OPT22基因組中，檢測了編碼T3SS（非鞭毛T3SS）核心組件（圖6A）的基因，以及四拷貝T3SS效應蛋白（T3E）同源分子，類EspA分泌蛋白（pfam03433）和HopW1-1（Hrp外蛋白）。進一步的分析揭示了兩種海綿相關細菌Shewanella sp. OPT22和S. spongiae KCTC 22492的T3SS基因簇的同源性（圖6A）。


VI型分泌系統(T6SS)在革蘭氏陰性菌中廣泛分布，與致病性、種內和種間競爭、細菌通訊（群體感應）和生物膜形成相關。在Shewanella sp. OPT22的基因組中，檢測到一個21 Kbp的T6SS基因簇，預測該基因簇編碼13個核心T6SS蛋白（圖6B）。對於S. spongiae KCTC 22492，T6SS相關基因位於兩個大小不同的T6SS-I (18 Kbp) 和T6SS-II (23 Kbp)基因簇中（圖6B）。T6SS-I 和T6SS-II編碼核心T6SS蛋白，可以表達完整的T6SS。T6SS基因簇在Shewanella sp. OPT22和S. spongiae KCTC 22492中是保守的，兩個海綿相關Shewanella spp.均編碼可能具有效應功能的hcpI (COG3157)和vgrG (COG3501)基因。


圖6 Shewanella sp. OPT22和S. spongiae KCTC 22492中檢測到的主要分泌系統


⏩ IV型分泌系統以及ANKs在海綿相關希瓦氏菌基因島的位置

T4SS與細菌接合系統同源，具有重要的生物學功能，即DNA交換介導水平基因轉移（HGT）及蛋白、蛋白-DNA複合體、效應/毒力分子轉移到目標細胞。Shewanella sp. OPT22的T4SSs位點編碼同源的毒力基因：virB2 (K03197), virB3 (K03198), virB4 (K03199), virB5 (K03200), virB6 (K03201), virB8 (K03203), virB9 (K03204), virB10 (K03195), virB11 (K03196)和virD4 (K03205)（圖7B）。這些VirB蛋白由virB操縱子合成，形成跨越細胞膜的菌毛和轉移通道，它還可能通過促進表面粘附、定植和生物膜的形成，促進發病機制/共生。有趣的是，T4SS位於Shewanella sp. OPT22的一個45 Kbp基因島（圖7A,B），基因島具有刪除、複製、接合轉移、整合到受體菌染色體的能力。


另一個海綿相關菌S. spongiae KCTC 22492具有多重T4SS基因簇，每個基因簇具有十個或更多基因（圖7C）。據報導，專性胞內寄生的Rickettsia spp.基因組攜帶多個T4SS基因簇，簇兩側是整合酶或tRNA基因，代表殘留的基因島，然而在S. spongiae KCTC 22492的T4SS基因簇兩側沒有觀察到整合酶或tRNA基因，雖然沒有檢測到基因島型T4SS，但在S. spongiae KCTC 22492的GIs中，存在7個編碼類錨蛋白結構域的基因（圖3B）。據報導，在專性細內寄生菌Babela massiliensis（寄生在Acanthamoeba castellaniiparasiti中），Orientia tsutsugamushi（寄生在trombiculid mites中），Burkholderia cenocepacia的GIs中，宿主-寄生菌相互作用相關的ANKs編碼基因富集。在海綿相關的Shewanella spp.的GIs中檢測到ANKs，清楚地表明獲得了某些適應性特徵，例如細菌對宿主免疫的逃逸，從而提高了在海綿宿主中存活的機率。然而，另一種海綿相關菌Shewanella sp. Alg231_23的GIs沒有編碼任何預測的ANKs，表明可能通過海綿相關的菌（Shewanella sp. OPT22 和S. spongiae KCTC 22492）中的HGT獲得了一些ANKs。


1. 展示了兩個與海綿相關的希瓦氏菌OPT22和KCTC 22492的特異性基因簇；

2. 編碼含錨定蛋白重複序列的蛋白的基因豐度對逃避宿主免疫反應有作用，其中OPT22（ANKs; n=45）和KCTC 22492（ANKs; n=52）；

3. 位於基因島的ANKs提示水平基因轉移在提高共生菌的生態適應性方面的作用；

4. 一些SS組件/效應蛋白作為毒力因子調節細菌與宿主的相互作用。

1. 通過對從海綿中分離出的Shewanella sp. OPT22菌進行了全基因組測序，並與其他Shewanella進行系統發育樹分析，提示系統發育與生活方式的關係。

2. 預測了Shewanella菌中與海綿共生相關的基因結構，包括III型分泌系統、IV型分泌系統、VI型分泌系統，以及錨定蛋白重複序列（ANKs）。


銳翌基因科服產品多元化，包括微生物組測序產品（16S/ITS擴增子、宏基因組、宏轉錄組和單菌基因組）、轉錄調控產品（原核轉錄組和真核轉錄組）和代謝組產品（非靶向代謝組和靶向代謝組），多組學結合分析，有助於高等院校、科研機構或醫院的科研工作者多角度、全面的探究和解決科學問題，助力更多優質科研成果發表。


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