今年PCR 實驗時間緊迫,如何一招翻盤?
2020-12-01 騰訊網實驗室最磨練耐心的實驗，PCR算是其中之一了。都說，PCR 和 WB 做不好，畢業肯定畢不了！
今年因疫情時間影響，相信後面實驗都非常緊迫，作為熟讀 protocol，與 PCR 進行過多次正面交鋒的實驗汪，為大家帶來一些血淚被虐經驗總結（附翻盤制勝法寶）。
1、沒有拓展條帶
可能的原因及對應的解決方案如下：
模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成 DNA 脫嘌呤而影響 PCR 的結果。
變性溫度是否準確：PCR 儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模板變性不徹底。
反應系統中汙染了蛋白酶及核酸酶，應在未加 Taq 酶以前，將反應體系 95℃ 加熱 5~10 分鐘。
酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。
2、產物量過少
可能的原因和對應的解決方案如下：
退火溫度不合適。以 2 度為梯度設計梯度 PCR 反應優化退火溫度。
DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。
PCR 循環數不足。增加反應循環數。
引物量不足。增加體系中引物含量。
延伸時間太短。以 1 kb/分鐘的原則設置延伸時間。
變性時間過長。變性時間過長會導致 DNA 聚合酶失活。
3、擴增產物跑電泳條帶彌
可能的原因和對應的解決方案如下：
酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。
dNTP 濃度過高。減少 dNTP 的濃度。
MgCl 濃度過高。可適當降低其用量。
模板量過多。質粒 DNA 的用量應
引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重複 PCR 反應。
循環次數過多；增加模板量減少循環次數至 30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的 PCR 循環。
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