來源：搜豬網
A．D．STUART T．D．K．BROWN A．P．A．MOCKETT 譚濤譯
豬繁殖與呼吸症候群是一種對現代養豬生產具有重要經濟意義的疾病—僅美國每年就造成了數億美元的損失Neumann et al．，2005)。該病的病原為豬繁殖與呼吸症候群病毒(藍耳病病毒)，它是一種動脈炎病毒，主要在肺泡巨噬細胞內複製。該病可以感染各種年齡的豬只，但呼吸症狀通常出現在青年豬。生殖症狀見於後備母豬和經產母豬，表現為流產、木乃伊胎、產下不能正常發育的弱仔。在妊娠最後的三個月裡，如果易感的懷孕母豬感染了藍耳
病毒將特別容易導致這些生殖症狀。藍耳病毒汙染的精液可以將該病傳染給母豬。
豬繁殖與呼吸症候群於l987年首次在美國報導，不久以後歐洲也出現該病。血清學調查表明加拿大的豬只在20世紀70年代感染此病(Rossow，1998)，在歐洲Wensvoort等首次分離到這種病毒(1991)，在美國由Collins等分離到(1992 0有意思的是美洲和歐洲分離株存在基因組和抗原性的差異。當進行胺基酸比對時，兩個毒株病毒表面的主要糖蛋白的差異達到40％。所以將這種病毒分類為1型(歐洲型)和2型(美洲型)。為什麼一個全新的病毒在兩個大陸沿著不同的譜系進化?為什麼它們又幾乎在同一時間發病?這些問題都有待解決。Hanada等(2005)提出，這種病毒大概在上世紀80年代從其他物種感染到了豬體，而且直到現在這種病毒還在改變著它糖蛋白上的跨膜區以適應豬體。有報導稱PRRSV在所有檢測過的RNA病毒當中進化速度是最快的。在其他的動脈炎病毒中，鼠的乳酸脫氫酶增高症病毒和藍耳病毒存在較近的親緣關係。
這種病毒高突變率的原因就是在這兩種類型的PRRSV存在巨大的基因和抗原性差異。Stadejek等(2002)報導了東歐的l型PRRSV毒株和其他的l型PRRSV之間的差別。根據早期的田間分離株研發的PRRSV疫苗初期證明很有效，但是野毒株的基因差異降低了疫苗效果。活疫苗可以減少野毒株造成的病毒血症，儘管還是可以從扁桃體分離出PRRSV。滅火苗似乎效果有限，即使被用來抵抗同源毒株的攻毒實驗也效果欠佳(Zuckermann et al．，2007)。1型PRRSV疫苗不保護2型野毒的攻擊(van Woensel et al．，l998 0疫苗株和野毒株的同時感染也是可能的。
替米考星可能有抗藍耳病病毒的效果(Molitoret al．，2001，Benfield et al．，2002)。愛樂新是一種大環內酯類的抗生素，學名叫萬樂黴素。以前發表的文獻(Stuart et al．，2007)表明萬樂黴素進入細胞並在胞內蓄積的速度比替米考星更快。泰樂菌素是另一種大環內酯類，它的胞內蓄積效果很差。本實驗的目的就是研究這三種大環內酯類抗生素在體外抗PRRSV的效果。
1材料與方法
1．1細胞系
由英國的吉米·格雷博士贈送的MAl04細胞。在格拉斯哥培養基裡添加10％的胎牛血清，100單位的青黴素(Invitrogen公司)和l00μg／mL的鏈黴素(Invitrogen公司)。
1．2藍耳病病毒株
歐洲株(1型)，DV株(英特威公司)為市場上購買的疫苗株。將此毒株在MAl04細胞上進行擴繁培養。存貯培養的病毒滴度為l08空斑形成單位／毫升。美洲型(2型)毒株，VR2332(Benfield et al．，1992)，來自美國標準菌種庫(ATCC。35℃下在MAl04細胞上擴繁病毒(按照菌種庫的要求)存儲培養物的滴度為5×107空斑形成單位／mL。
1.3大環內酯抗生素
由伊科動物保健公司提供的口服用愛樂新溶液。該商品含有抗生素萬樂黴素。替米考星預混劑Pulmotil(含有250m9／mL的鹽酸替米考星)和Tylan(含l9／g泰樂菌素)均購買自Elanc0動物保健公司。
1.4測定三種大環內酯類藥物的抗藍耳病效果
將105MAl04細胞在24孔板上培養。將24孔板在37℃下過夜培養。37℃下用不同濃度的大環內酯類抗生素處理4h時。在抗生素孵育的細胞裡，用10空斑形成單位每個細胞的感染複數分別感染1型和2型藍耳病毒。細胞在適合的溫度下培養20h，然後用4％(體積比)的甲醛／鹽酸鹽緩衝液固定。用間接免疫螢光來測定感染情況。
1．5免疫螢光
在室溫下用0．2％的Triton X—I00／PBS處理細胞5min以增加其滲透性。用單克隆抗體檢測l型藍耳病毒的核衣殼蛋白，單克隆抗體由瓦格寧根大學的Michael Kroese博士惠贈。2型藍耳病毒用單克隆抗體2D6來檢測病毒的核衣殼蛋白。抗體分別按1／10和1／500的比例溶解在0．2％胎牛血清的PBS中，在室溫放置30min。將樣品用PBS—NCS洗滌兩次。第二抗體是羊抗鼠IgG，將其偶聯到Alexa Flu—or 488(Invitrogen公司)，在室溫條件下以l／1000的比例加入到PBS—NCS中，孵育30min。將樣品用PBS—NCS洗滌2次。用含有DAPI(4，6一二脒基一2一苯基吲哚鹽酸鹽)的封固劑(Invitrogen公司)將培養板的蓋子封閉在載板上，然後用共聚焦顯微鏡觀察。所有的細胞都用DAPl染色，藍耳病毒陽性的細胞用螢光染色。
1．6吖啶橙細胞染色
將105MAl04細胞接種培養到24孔板內。將24孔板在37。C下過夜。在不同的濃度下用大環內酯類抗生素處理細胞4h，或者不做處理。加水配製成2mol／L的吖啶橙儲備樣品(Invitrogen公司)並加到組織培養基內，達到最終濃度為20μmol／L。將細胞在室溫下孵育lh，然後用PBS洗兩次。移除培養板蓋子後立刻放在載玻片上。用共聚焦顯微鏡來進行觀察。在酸性的細胞區域(次級內體和溶酶體)不見綠色螢光，他們呈現紅色螢光，對20個細胞內的紅色螢光點進行計數，把它們的平均數量排列成圖表。
2結果與分析
2．1大環內酯類的抗病毒效果
圖1顯示的是愛樂新和替米考星對1型藍耳病毒感染的抑制效果。從圖中可以清楚的看到，用愛樂新處理過的MAl04細胞減少了PRRSV抗原的表達。每次處理後，表達PRRSV抗原的細胞數僅僅是細胞總數的一部分，圖2就是具體量化的指標。當使用愛樂新的濃度為0．1μg／mL的時候，l型藍耳病的複製降低了將近50％。替米考星也有抗病毒作用，雖然在濃度為0．1μg／mL的時候並沒有抑制效果，但是當濃度為lμg／mL的時候PRRSV陽性細胞數減少到了50％。當替米考星濃度為l0μg／mL細胞有毒性作用。泰樂菌素沒有抗病毒作用，即使在濃度達到100μg／mL的時候也沒有效果。
用愛樂新和替米考星將MAl04細胞在特定的濃度下處理4h，然後用l型PRRSV(DV株)感染，感染複數為10~20h後固定細胞，用間接免疫螢光檢測病毒感染的細胞，綠色螢光為病毒的核衣殼蛋白，紅色螢光為α一微管蛋白。
按前文的方法將MAl04細胞用抗生素處理並進行病毒感染。20h後固定細胞，用間接通過免疫螢光的方法來檢測病毒核衣殼蛋白，以此來檢測病毒感染的細胞。用DAPI(4，6一二脒基一2一苯基吲哚鹽酸鹽)將細胞核染色後計數，從而算出細胞感染率的百分比。
用2型PRRSV(美洲株)進行實驗時也得到了相同的結果，如圖3所示。實驗結果顯示：在使用0．1μg／mL愛樂新的時候，可以將PRRSV陽性細胞的數量減少到約50％，愛樂新濃度為l0μg／mL的時候，PRRSV陽性細胞數降到了2％以下。替米考星濃度為lμg／mL的時候可以把PRRSV陽性細胞數降到約50％，泰樂菌素在濃度為lμg／mL的時候沒有抑制藍耳病病毒複製的功能。
MAl04細胞用抗生素處理，然後感染2型藍耳病毒(VR一2332株)。20h後固定細胞，用間接免疫螢光的方法來檢測病毒感染的細胞，DAPl細胞核染色後計算感染細胞的百分比。
2．2大環內酯類對內體pH值的影響
為了檢測愛樂新抗病毒效果的機制，本文作者研究了愛樂新和其他大環內酯類藥物是否對內體的pH值有影響。使用吖啶橙作為酸性細胞器的指示劑。
MAl04細胞中吖啶橙染色的次級內體／溶酶體的平均數如圖4所示。使用泰樂菌素時，濃度達到100μg／mL的時候也不會減少經吖啶橙染色的次級內體數，但是在培養基中替米考星的濃度為1．0μg／mL的時候可以觀察到吖啶橙染色的次級內體數有略微的減少。0．1μg／mL濃度的愛樂新少量的減少了酸|生內體的數量，單個細胞中，呈紅色的次級內體／溶酶體的數量從73減少到了68。當愛樂新在培養基中的濃度為l．0μg／mL時就大大的減少了酸性內體的數量，每個細胞中酸性內體的數量僅為10(見圖5)。
用愛樂新、泰樂菌素、替米考星處理MAl04細胞，在特定的濃度下處理4h。然後用2μmol／L的吖啶橙處理lmin。將細胞樣品用PBS洗下來放到載玻片上，然後用共聚焦顯微鏡進行觀察。吖啶橙染色的細胞呈綠色螢光，而酸性的細胞器如次級內體／溶酶體呈紅色螢光。按前文提到的方法用大環內酯類處理MAl04細胞，然後進行吖啶橙染色。對每個細胞中的紅色螢光細胞器進行計數，算出在每組抗生素特定濃度下的平均值。