Microbiome Search Engine 2 第二代微生物組搜尋引擎：全球微生物組結構和功能搜索的平臺
Microbiome Search Engine 2: a Platform for Taxonomic and Functional Search of Global Microbiomes on the Whole Microbiome Level
mSystems [6.633]
原文連結：https://doi.org/10.1128/mSystems.00943-20
第一作者：Gongchao Jing, Lu Liu
通訊作者：Jian Xu(徐健), Xiaoquan Su(蘇曉泉)
主要單位：青島大學計算機科學技術學院，中國科學院青島生物能源與過程研究所單細胞中心
摘要
來自不同環境的宏基因組數據集的數量正在迅速增長。隨之而來的問題也不斷湧現，例如如何快速的訪問某一數據集，以及如何快速的通過對比發現新微生物群落與現有微生物群落之間的關聯等。Microbiome Search Engine 2（MSE 2）是第二代的微生物組搜尋引擎，為解決以上類型的問題提供良好的解決方案。MSE 2可以根據微生物組整體的物種結構或功能，在全球已有的微生物組數據集中搜索高度匹配的樣本。MSE 2由以下三部分組成：（i）不斷更新的微生物組資料庫。該資料庫目前包含來自於798項研究的250,000多個宏基因組和16S rRNA擴增子樣本，每一個樣本的測序數據和元數據都進行了統一化處理；（ii）增強的搜尋引擎。實時級快速搜索，能夠在0.5秒內，從整個資料庫中搜索到與給定的微生物組在整體組成或功能上最相似的樣本；（iii）基於Web的圖形界面。用戶可通過http://mse.ac.cn免費訪問MSE 2。該網站提供了簡單易用的圖形界面，方便用戶快速上手樣本搜索、數據瀏覽等操作，同時也為自定義的搜索提供了教程。如果用戶想對自有的微生物組數據集來構建資料庫並進行搜索，我們在GitHub （https://github.com/qibebt-bioinfo/meta-storms）上也提供了MSE 2搜尋引擎的內核程序。
關鍵詞
擴增子（amplicon）,宏基因組（metagenome）,微生物組（microbiome）,在線服務（online service）,搜尋引擎（search engine）
前言
宏基因組學能夠建立起微生物組與周圍環境之間的動態關聯，已被廣泛應用於探索不同環境中的微生物群落，比如環境狀況的改變 [1,2]，疾病發展 [3-7]，藥物反應 [8,9]等。隨著取樣策略和測序技術的快速發展，海量的微生物組數據集正在不斷產生，包括16S rRNA基因擴增子測序數據和鳥槍法宏基因組測序（shotgun whole-genome sequencing, WGS）數據。這些數據集既來自於大型的研究項目例如Human Microbiome Project [10]、Earth Microbiome Project [11]、American Gut Project [12], 以及Tara Oceans [13]，也來自於小型的研究項目甚至個人。這些數據大都存儲在通用的DNA序列存儲庫（例如NCBI SRA [14]）或微生物組特異性資料庫（例如MG-RAST [15]和EBI Metagenomics [16]）中。為了有效的對這些數據進行大規模的數據挖掘，目前已經有了幾款使用統一序列處理和標準操作流程（SOP） [17]的分析管理平臺，例如Qiita [18]，gcMeta [19]和GMrepo [20]等。這些工具通常都提供基於Taxonomy分類單元（例如物種名稱）、序列片段甚至是類似於結構化查詢語言（SQL）的元數據查詢。但是，當新的微生物組產生後，仍然不能根據其整體尺度上物種或者功能組成的相似性，從現有資料庫中搜索到高度相似的匹配樣本。為了填補這一領域的空缺，前期我們開發了微生物組搜尋引擎Microbiome Search Engine（MSE）[21]，並實現了一種基於菌群大數據搜索的多疾病檢測新策略，尤其是在處理多隊列數據、多測序平臺數據和抵抗汙染物的方面表現出了顯著的優勢 [22]。但是，MSE也有它的局限性，即僅支持16s rRNA擴增子測序數據，因此MSE只能針對擴增子OTU（Operational Taxonomy Unit）的相似性進行搜索 [21]。
Microbiome Search Engine 2（http://mse.ac.cn）是第二代微生物組搜尋引擎。它突破了以上的限制，不僅同時支持16S rRNA擴增子測序數據和鳥槍法宏基因組測序數據作為搜索輸入（圖1a），而且在「物種組成」相似性基礎上，增加了根據微生物組「功能」相似性的搜索。MSE 2包括以下三個主要部分（圖1b）：
（i）不斷更新的微生物組資料庫。該資料庫目前包含來自於798項研究的250,000多個WGS宏基因組和16S rRNA擴增子樣本，每一個樣本的測序數據和元數據都進行了統一化處理；
（ii）增強的搜尋引擎。實時級快速搜索，能夠在0.5秒內，從整個資料庫中搜索到與給定的微生物組在整體組成或功能上最相似的樣本；
（iii）基於Web的圖形界面。用戶可通過http://mse.ac.cn免費訪問MSE 2。該網站提供了簡單易用的圖形界面，方便用戶快速上手樣本搜索、數據瀏覽等操作，同時也為自定義的搜索提供了教程。
結果
微生物組資料庫
（i）數據的收集和歸納整理。MSE 2的數據主要來自Qiita [18]、EBI [16]、SRA [14]和MG-RAST [15]這幾個數據倉儲。為了保證微生物組樣本之間的技術可比性和可檢索性，我們對這些樣本進行了統一化的處理：一是在保留原始元數據的基礎上，我們從每項研究和以及其樣本中選擇比較常用的元數據項，將其手工整理成統一的特定格式（表1）；二是我們根據序列類型（基於擴增子測序或基於WGS測序；表2），對序列進行了統一的預處理和分析。
（ii）資料庫統計數據。通過對數據的預處理和整合後，共有來自798個項目/研究的250,273個微生物組樣本收錄進了MSE2的資料庫，其中鳥槍法宏基因組測序樣本有14,957個，16S rRNA擴增子測序樣本共有235,334個。從採樣源分布來看（圖2），人體菌群樣本最多（共佔52.8%，其中：腸道，34.2%；皮膚，9.1%；口腔，6.4%，等），接下來依次是來自動物（23.7%）、土壤（6.4%）、室內環境（5.7%）和海洋環境（2.7%）。
（iii）資料庫的組織和管理。所有微生物組樣本被組織成兩個維度（圖3）。對於基於web的數據瀏覽（參考下面的「數據瀏覽和下載」部分），樣本是按照其所屬的研究項目進行組織的，可以通過各種元數據（如棲息地、序列類型、年份等）進行選擇和過濾。對於基於微生物組結構或功能相似性的搜索，樣品會根據多種特徵的組合（例如，OTU，物種，或KO（KEGG Orthology）功能注釋）進行組織，以進行索引和搜索（詳情請參閱下面的「增強的微生物組搜尋引擎」部分）。
增強的微生物組搜尋引擎
（i）全微生物組水平的搜索。MSE 2的搜尋引擎內核由C++編寫，並使用OpenMP技術實現了並行計算和優化。每次搜索，MSE 2都會檢索整個微生物組資料庫，以找到結構或功能相似性最高的最佳匹配樣品。搜索結果包含匹配項的物種組成或功能概況，匹配項與搜索使用的樣本的相似程度及元數據信息（請參見「搜索及結果展示」的部分以了解更多詳細信息）。與先前版本MSE [21]相比，MSE 2除了支持基於16S rRNA OTU，還增加了基於物種名稱和基於代謝功能（KO）的搜索（圖4a）。
（ii）搜索速度和任務調度。得益於兩級索引的搜索策略（圖4b），MSE2的搜索速度要比窮舉搜索快1至2個數量級。為了測試MSE 2的索引效率和搜索速度，我們對整個資料庫執行了基於OTU、基於物種和基於功能的搜索，並將搜索時間與禁用索引的窮舉搜索（窮舉搜索僅用於內部評估，未在MSE 2的線上服務中提供）進行比較。每個過程重複10次，每一次僅對搜索耗時進行記錄和比較（不包括數據上傳時間，可視化時間和Web頁面加載時間，以避免由於系統和網絡延遲引起的潛在偏差）。結果顯示，對於基於OTU，基於物種和基於功能（KO）的搜索，兩級索引策略分別將搜索速度分別提高了193倍、15倍和605倍（圖4c和表3）。針對超過250,000個樣本的全微生物組級搜索的實時響應在0.5 s之內。另外，在線搜索服務遵循基於隊列的任務調度實現的「先到先服務」的原則，從而有效地利用了計算資源。
基於web的圖形化入口
（i）基於Web的用戶界面。MSE2的網址是http://mse.ac.cn，可通過任何Web瀏覽器免費訪問。該網站的後臺程序使用PHP和MySQL編寫，並部署在Linux伺服器上，前端的web程序提供了一個簡單易用的圖形界面（圖5），用於搜索，數據瀏覽以及數據的上傳和下載。用戶可以通過網站上的教程來學習如何調整參數，以實現自定義搜索功能和結果展示。網站的頁面上也會定期發布資料庫更新，系統維護和其他相關信息的通知。用戶還可以在幫助頁上提交問題或錯誤信息，我們將通過電子郵件的方式進行回復。
（ii）搜索及結果展示。MSE 2接受微生物組樣本的OTU、物種或KO功能作為搜索輸入。因此，搜索之前需要將測序序列進行預處理，使之具有與資料庫樣本相同的形式。表2列出了推薦的用於每種序列類型的序列處理軟體，詳細的分析方法可通過在線平臺「搜索」或「幫助」頁面獲得。搜索的第一步，用戶首先要根據搜索輸入的類型從「按OTU搜索」（by OTU），「按物種搜索」（by species）和「按功能搜索」（by function）中進行選擇（圖5b）。 然後，輸入數據可以以文本文件的形式上傳，也可以直接粘貼到網頁的文本框中。用戶還可以指定其他參數，例如最大匹配數（默認為10）和最低相似度（默認為0.6）。在結果頁面（圖5c）中，列出了資料庫中與輸入的樣本最相似的樣本，其中包含資料庫樣本ID，採樣環境和相似性。對於「按功能搜索」，如果匹配結果是基於16S rRNA序列來預測的功能，搜索結果中也會顯示其NSTI（Nearest Sequenced Taxon Index）值，用於表示功能預測的可信度。搜索結果中，每個樣品的ID均連結到其詳細完整元數據（例如，來源研究，採樣地點，序列類型等）的相應頁面。輸入微生物組和其匹配結果的物種或功能組成會以柱狀圖或Krona [23]繪製的動態圖展示出來，方便查看它們之間的聯繫和區別。此外，以上所有搜索結果都可以在結果頁面上進行打包下載，以方便用戶進行後續的meta-analysis和數據挖掘。
（iii）數據瀏覽和下載。MSE2的網站上提供了兩種樣本瀏覽的方式：
A. 按項目/研究瀏覽。在項目列表頁面，樣本按照項目進行排列，所有的項目會按照項目ID進行排序。單擊項目ID可以進入項目頁面，該頁面包含每個項目的統一化元數據（例如，研究的標題，出版信息等等）（表1），該項目的完整原始元數據，以及訪問該數據原始發布頁的連結。
B. 按樣本瀏覽。在樣本列表頁面中，所有的樣本會以列表的形式展示並按照樣本號進行排序。用戶可以對樣本列表進行篩選，目前支持的篩選條件有元數據過濾器，環境，序列類型，採樣年份等等。點擊樣本ID還可以查看由Krona [23]繪製的物種組成動態圖。
結論與討論
本文中，我們介紹了Microbiome Search Engine 2（MSE 2），該平臺具有以下兩大特性：（i）海量的數據，該資料庫包含來自於798項研究的25萬個微生物組樣本，並且這些樣本都進行了統一化的處理；（ii）增強的搜尋引擎，能夠進行實時級（每次搜索耗時<< span="">0.5 s）快速搜索，搜索條件也從僅支持OTU信息擴展到了支持物種和功能信息。目前已經有研究證明了基於搜索的策略對於定義微生物組樣本的新穎性 [21]和跨隊列疾病診斷 [22,24]的價值。通過為MES 2和其他相關軟體添加功能相似性這一維度，MSE 2可以加速對不斷擴大的宏基因組數據空間的大規模數據挖掘。
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