在其研究中，巴甫洛夫始終如一地尋求生理系統——心臟、消化和大腦皮層——運作的「窗口」。精確的活體解剖方法有其可取性，但可惜，這些方法經常破壞了身體的固有機能，阻撓了巴甫洛夫觀察活的系統的目標。他模仿人的外科手術，設計了嚴格的外科手術方法；他的狗在做手術前要經過四個外科手術準備室。在那個還沒有抗生素的年代，他的實驗室裡從未發生過一例敗血症。巴甫洛夫是一個手藝精湛的外科醫生，從未讓他的實驗動物在外科手術中死去。1888年，他迎來了首次重要的成功，當時他隔離了一顆仍在活動著的哺乳動物心臟。這是人們第一次直接觀察到心臟的活動。
在尋找消化系統上的窗口時，巴甫洛夫設計了一個手術。這個手術把一個「微型胃」從器官中分離出來，放在一個囊袋中，以便他能夠觀察狗的胃中發生的腺體活動而不會被正在消化著的食物所汙染。在巴甫洛夫之前，許多實驗者都曾試圖開發這樣一個囊袋。在德國時，巴甫洛夫曾在布雷斯勞學習過海登海因的手術方法，但是海登海因的嘗試並未成功。
巴甫洛夫最初也遭遇到許多困難。他的前十九次手術都以失敗告終，但是在第二十隻動物身上，他成功地將一個微型胃分離進一個囊袋中。到最後，巴甫洛夫在做這個「巴甫洛夫囊袋」時如此嫻熟，以至於在旁觀者意識到手術已經開始之前，手術通常已經結束。隨著一小部分胃的外現，巴甫洛夫擁有了一個消化系統上的窗口。他研究了狗吃不同食物時，以及被切斷食道以使食物不能到達胃中時的胃液成分。在這些假飼條件下，狗吃的是巴甫洛夫所謂的「虛擬食物」，但是在進食後一段時間胃液開始流出。這種胃的反射在胃中沒有食物的情況下發生；它由神經系統中一種更高級的中樞引起。巴甫洛夫稱之為「心理反射」。
巴甫洛夫通過植入囊袋壁上的用塞子塞住的瘻管收集胃液。他的狗每天產生20升純淨的胃液；巴甫洛夫把他的實驗室稱作一個「胃液工廠」。機靈的巴甫洛夫將這些胃液出售給那些消化不良的人們，作為輔助消化之用；而出售這些胃液可以掙得他實驗室一年研究經費的一半。鑑於這些胃液嘗起來糟糕透頂且療效可疑，巴甫洛夫必定是個厲害的銷售者。
巴甫洛夫在發表於1897年的《消化腺機能講義》以及1903年4月28日在西班牙馬德裡召開的國際醫學大會上的一篇論文中報告了這些研究成果。這些報告取得巨大成功，為巴甫洛夫贏得了國際聲譽和1904年的諾貝爾醫學獎。當他作為諾貝爾獎獲得者發表獲獎演說時，聽眾們毫無疑問希望巴甫洛夫講述他關於消化的實驗。但是他反而講述了他通過最近發現的窗口「心理反射」所觀察到的內容。從1891年起，巴甫洛夫和他的學生們開始關注狗在平時偶爾而非在餵食時分泌的胃液和唾液。最初，這些反應只是幹擾研究消化的「討厭的東西」，但是此後巴甫洛夫開始對其進行更為系統的研究。
1891年，格奧爾基·奧弗叄尼斯基在其博士論文中探討了唾液腺對多種刺激的反應。奧弗叄尼斯基的研究方法包括向唾液腺內注射血清並觀察唾液管內的流出物。為簡化實驗，瘻管植入狗的唾液腺內以收集唾液。通常，在狗看到食物但沒有吃到食物時，看到經常盛食物的盤子時，甚至在聽到給它們餵食的實驗室工作人員的腳步聲時，都會流口水。因為這些都不是唾液的適宜生理刺激，巴甫洛夫稱之為「心理刺激」。
巴甫洛夫相信研究這些刺激及其引起的反應將會揭示大腦半球的秘密。然而，其他人並不相信，一些生理學家同行認為他的實驗研究至多是準科學。偉大的英國生理學家查爾斯·謝靈頓就曾建議巴甫洛夫回到真正的生理學上來，雖然他後來也承認巴甫洛夫研究的重要性。
在實驗中，巴甫洛夫運用了多種可引起條件反射的刺激，或稱條件刺激：節拍聲、蜂鳴聲以及觸覺和熱感刺激。他盡力把他的動物與研究以外的其他刺激隔離開來。巴甫洛夫設計了一個特殊的實驗室——「寂靜之塔」，用兩英尺厚的泥灰牆來隔音。在實驗者與狗相隔離的雙重房間裡，他對狗進行測試。在餵食物之前，給狗呈現一個條件刺激。若干次這樣的匹配之後，巴甫洛夫發現僅僅呈現這個刺激就可以引起唾液分泌。這個現象他稱為條件反射，巴甫洛夫建立了一個程序，這一程序讓各種刺激獲得引起反射反應的能力。蜂鳴聲、節拍聲以及觸覺和熱感刺激在一般情況下是不會引起唾液分泌的，只有在條件反射作用之後，它們才有能力做到這一點。