原創 孫丹雄 醫學界呼吸頻道 收錄於話題#孫丹雄醫生12個
有用！
前 言
診斷肺部感染性疾病的金標準是什麼？
痰塗片檢查發現哪些細菌有確診價值？
哪些標本需要冷藏保存、哪些必須室溫？
弱抗酸染色可檢測哪些病原體？
呼吸道標本培養到麴黴是否可以診斷麴黴感染？
培養出馬爾尼菲青黴是否可以確診？
下呼吸道標本分離培養到非典型病原體是否可以確診？
宏基因組測序結果，序列數高就一定是感染嗎？
序列數低也並非一定不是致病原？
最近，中華結核和呼吸雜誌發表了《成人呼吸系統感染性疾病病原學診斷專家意見》，乃呼吸科醫生年度必看專家意見，對臨床醫生幫助非常大，下面和各位小夥伴分享其中的精華內容。
看完這個專家意見，以後我們送檢微生物、使用抗生素會更加明智、更加規範。
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呼吸道病原學檢測標本的採集方法
標本採集相當於蓋第一層樓，這個地方出錯了，後面的結果就很難準確的分析。
組織活檢標本是診斷肺部感染性疾病的金標準。
首先選擇非侵入性方法（無創或微創檢查），假如非侵入性方法不能確診，必要時選擇有創檢查方法。
特別注意的是，對於胸腔積液標本採集：標本量方面，細菌培養≥1 mL，真菌培養≥10 mL，分枝桿菌培養≥10 mL，結核T-SPOT檢查需要添加抗凝劑。
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標本的運送、儲存與預處理
嚴格無菌操作：個人覺得，從引流管抽取胸水行微生物檢查的價值非常有限，胸水培養最好在胸腔穿刺時留取標本。
儘快送檢標本，應在採樣後2小時內送達實驗室，樣本量少的標本應於30分鐘內送檢，要不然標本很可能幹涸，微生物都死翹翹了，送去檢驗科也沒用。
常見標本，除了病毒轉運培養基（行病毒培養）需要冷藏保存外，其他的標本包括病毒拭子轉運管、血培養、痰培養等等，全部都是室溫保存後，2 h內送檢。
組織液、體液、灌洗液等標本行細菌培養，以及病毒轉運培養基，需要立即送檢。
弱抗酸染色可檢測奴卡菌；肺孢子菌不能培養，只能行六胺銀染色、核酸檢測及抗原檢測；寄生蟲感染也不能培養，只能顯微鏡下檢查，或行核酸檢測及抗原檢測。
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呼吸道病原檢測方法的優缺點
測定藥物敏感度的方法主要有以下三種：
傳統的藥敏方法：直接測量細菌對抗菌藥物的敏感度。
自動化檢測技術：通量高，比傳統方法更加快速。
分子生物學方法：直接對耐藥基因進行檢測，但是大多數細菌的耐藥有多種因素參與，基因型與表型並不完全相同（比如沒有測到耐藥基因≠敏感），選擇抗菌藥物需綜合分析。
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病原檢測結果的判讀及其臨床價值
4.1直接抗原快速檢測
抗原檢測可測細菌抗原（尿肺炎球菌抗原）、非典型病原體抗原（尿軍團菌抗原），以及真菌抗原，例如1,3-β-D-葡聚糖試驗（G試驗）、半乳甘露聚糖試驗（GM試驗），應注意假陽性和假陰性結果。
抗原快速檢測病毒的敏感度低（假陰性率高），若臨床高度懷疑病毒感染，應加做病毒核酸檢測，以排查假陰性。
4.2血清特異性抗體檢測
體液免疫缺陷的患者可呈假陰性，早期陽性率較低，需要採集急性期及恢復期雙份血清進行評價（抗體滴度在恢復期較急性期升高4倍以上價值才大）。
新型冠狀病毒肺炎的患者，在感染後3~5天即可檢測到病毒特異性IgM，但是IgM陽性不一定就是新冠病毒感染，有可能是假陽性（所以現在不用抗體篩查感染者了，還是核酸更靠譜）。
4.3塗片檢查
肺穿刺標本和胸腔積液塗片發現病原體對確診具有重要意義（前提是標本沒有被汙染）。大家最熟悉的莫過於塗片查到抗酸桿菌，價值巨大，雖然不能區別結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，另外螢光塗片鏡檢查抗酸桿菌的敏感度高於傳統的萋-尼染色。
塗片鏡檢發現寄生蟲滋養體、包囊或卵囊、蟲體、蟲卵可作為確診依據。改良抗酸染色可發現隱孢子蟲卵囊，發現剛地弓形蟲滋養體或包囊需要吉姆薩染色，比氏微孢子蟲需要改良三色染色法，並殖吸蟲蟲卵、阿米巴原蟲滋養體可直接塗片鏡檢。
念珠菌是口腔常見的定植菌，呼吸道標本塗片發現真菌孢子或菌絲時，應根據臨床表現綜合判斷是定植還是感染。黏蛋白卡紅染色可用於發現隱球菌，但不能作為隱球菌肺炎的診斷依據。
BALF（支氣管肺泡灌洗液）或誘導痰，行六胺銀染色或免疫螢光染色法鏡檢發現肺孢子菌，可作為肺孢子菌肺炎的確診依據。合格痰標本、氣管內吸引物、BALF或刷檢標本鏡檢發現較為特異的菌絲（麴黴或毛黴絲）可作為診斷肺麴黴病、毛黴病的微生物學依據（注意，微生物學依據≠確診），但塗片陽性率遠低於培養陽性率。
合格下呼吸道標本分離到支氣管炎博德特菌、土拉熱弗朗西斯菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞桿菌可以作為確診依據；但鏡檢見到典型革蘭陽性柳葉刀樣雙球菌，如果每個油鏡視野中肺炎鏈球菌超過10個對診斷有參考意義。合格下呼吸道標本塗片鏡檢與培養結果一致（如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌等）對診斷有重要參考意義。經氣管導管吸引分泌物塗片革蘭染色，若每個高倍鏡視野檢出2%以上白細胞有微生物吞噬現象，對病原學診斷有參考價值，可作為初始經驗性抗感染治療的依據。
4.4培養
微生物培養的前提是標本要合格。
肺組織活檢標本培養陽性是診斷真菌感染的重要依據，但也要注意排除汙染的可能。即使是下呼吸道分泌物、BALF（支氣管肺泡灌洗液）也需除外定植或汙染。
臨床標本分離培養出馬爾尼菲青黴是診斷該病的金標準。目前的研究顯示，確診肺組織胞漿菌病，需要組織學和微生物學檢查同時發現該菌。新型隱球菌可以寄生於健康人群，隱球菌培養陽性可以作為診斷的重要參考依據，但應結合臨床具體情況判斷是否為感染。
痰標本培養連續2次分離到同種麴黴及BALF單次培養陽性可作為診斷肺麴黴病的微生物學依據（注意，微生物學依據≠確診）。痰培養念珠菌陽性難以區分定植或感染，臨床意義有限，即使保護毛刷標本培養陽性也不能作為診斷侵襲性肺念珠菌病的依據，但如果痰、誘導痰或BALF標本鏡檢時發現大量出芽菌體和念珠菌菌絲，提示念珠菌處於快速繁殖期，具有一定的臨床指導意義。
病毒培養耗時長，陽性率偏低，不建議常規應用，主要用於科研。
下呼吸道標本分離培養到非典型病原體（支原體、衣原體等）可以確診，但耗時長，陽性率偏低。
胸腔積液、肺活檢標本培養到病原菌，下呼吸道標本培養出支氣管炎博德特菌、土拉熱弗朗西斯菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞桿菌可作為確診依據。前提是沒有汙染，比如從胸腔閉式引流管裡面抽出的胸水，中心靜脈導管裡面抽的血就很難排除汙染。
痰定量培養的細菌濃度≥107 cfu/mL、經氣管內吸取物細菌培養濃度≥105 cfu/mL、BALF培養細菌濃度≥104 cfu/mL或保護性毛刷標本細菌培養濃度≥103 cfu/mL時，致病菌的可能性較大。
4.5核酸分子擴增檢測和基因晶片檢測
多重PCR使用多對引物同時擴增時，可能出現引物間相互幹擾，影響其敏感度和特異度，造成假陰性或假陽性；核酸檢測陽性結果需結合臨床實際情況，分析究竟是定植菌還是致病菌。
4.6宏基因組測序和16S rRNA基因測序
16S rRNA測序可同時半定量檢測樣本中所有細菌（只能測細菌）的16S rRNA基因；宏基因組技術（NGS）可對樣本中所有微生物（細菌、真菌、病毒、寄生蟲等）的全基因序列進行測序，可以更準確地鑑定到細菌、真菌、病毒等各種病原體的種水平。
宏基因組測序（NGS）可覆蓋幾乎所有病原體（細菌、真菌、病毒、寄生蟲等），簡直就是王者無敵、雨露均沾，但仍有一定缺陷，如胞內菌感染（如結核分枝桿菌）因病原體或其核酸釋放到體液中的含量較低，可能導致檢測敏感度偏低；某些真菌的細胞壁較厚，破壁困難導致敏感度下降。
對於新冠病毒，宏基因組測序首先提示出新型病毒致病原的信息，後來的事情大家都知道了，雖然很遺憾，但是說明宏基因組測序前途無量。
宏基因組測序有種王者歸來的感覺，但目前它還在研究之中，沒有必要盲目跟風，因為它目前還有一個遺憾：宏基因組測序結果，序列數高並不一定是致病原，數目低也並非一定不是致病原，受標本中病原體數量、核酸提取量和測序數據量、標本中人源序列豐度等因素的影響，還是需要結合臨床綜合判斷。
後記
有醫生經常喜歡用氟康唑治療肺部真菌病，問其為何這樣用藥，答曰：痰培養到念珠菌。詢問還有其他理由嗎？答曰：沒有了，就是痰培養到念珠菌。
有些醫生看到微生物培養結果，不假思索立馬就更改抗生素，這並不妥當。結合臨床資料綜合分析病情，是我們臨床醫生的根。
希望這個專家意見可以給我們更多的啟發，大膽的嘗試新思想，脫離固有的思維模式。
參考文獻：
中華結核和呼吸雜誌2020,43(9):757-764。DOI：10.3760/cma.j.cn112147-20200212-00081.
本文首發：醫學界呼吸頻道
本文作者：雲南省一院 孫丹雄
原標題：《肺部感染的診斷金標準是什麼？「專家意見」的4大亮點一文整理！》
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